【摘 要】
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药物靶点发现是表型筛选研发小分子药物的一个瓶颈问题,现有靶点发现方法包括筛靶和钓靶两大类,其中钓靶方法主要是利用小分子或其衍生物作“鱼钩”,从总蛋白中钓取靶蛋白,通过清洗去除杂蛋白,富集靶蛋白后解析其身份。然而现有钓靶技术均具有局限性,目前亟需开发一种高效准确的找靶方法。为此我们在PROTACs基础上设计了一种新型钓靶系统,命名为苏鲁锭（Trifunctional Click on Ubiquit
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药物靶点发现是表型筛选研发小分子药物的一个瓶颈问题,现有靶点发现方法包括筛靶和钓靶两大类,其中钓靶方法主要是利用小分子或其衍生物作“鱼钩”,从总蛋白中钓取靶蛋白,通过清洗去除杂蛋白,富集靶蛋白后解析其身份。然而现有钓靶技术均具有局限性,目前亟需开发一种高效准确的找靶方法。为此我们在PROTACs基础上设计了一种新型钓靶系统,命名为苏鲁锭（Trifunctional Click on Ubiquitin Target Identification,Tr LUTI）。Tr LUTI包含三条“手臂”,分别连接小分子、氯代烷烃和叠氮基团,以便通过点击化学使小分子和靶蛋白上的功能化泛素形成共价键连接,并通过生化富集获得直接靶点。我们构建了Tr LUTI的各组分并有以下发现:1.利用Pyl RS/t RNAPyl分子对,将泛素K48替换为带有炔烃基团的非天然氨基酸Plk,获得带有炔烃基团的泛素Ub K48Plk。在泛素N端连接可结合生物素的肽段,使用相同方法替换K48为Plk,获得了既可以通过生物素纯化,又可以通过炔烃发生点击化学的双功能泛素Bio Ub K48Plk。每升细菌培养可纯化获得50mg Bio Ub K48Plk,随后又成功表达和纯化了K63替换为Plk的Ub K63Plk和Bio Ub K63Plk。2.低剂量Bio Ub K48Plk及Ub K48Plk可抑制Parkin天然底物TUBA1A的原本降解途径,Bio Ub K63及Ub K63Plk无此抑制效应。随着剂量的增加,Bio Ub K48Plk及Ub K48Plk又逐渐激活TUBA1A降解,其效率呈剂量依赖式反应。鉴于K48泛素链与K63泛素链分别介导蛋白酶体及溶酶体降解途径,这一反应的特异性（仅在K48插入Plk的功能性泛素出现）及作用模式提示其激活了另一降解途径,可能是溶酶体降解途径。3.利用第二代慢病毒侵染系统,成功获得了稳定表达m Neon Green FKBP12F36V和Halotag-Parkin的HEK293T细胞系,利用此细胞系研究Tr LUTI的钓靶功能,结果发现:（1）Tr LUTI可利用双功能泛素诱导靶蛋白FKBP12F36V降解;（2）确定了上述诱导靶蛋白降解作用所需溶液盐浓度、时间、温度、ATP浓度和剂量范围。Tr LUTI和Bio Ub联用,在700m M Na Cl、2m M ATP溶液中,37℃孵育4 h时,可见FKBP12F36V显著降解;Tr LUTI使用浓度为0.67-0.0027μM时,FKBP12F36V均可被降解,更高浓度则不被降解,可能是三元复合物体系中的“钩状效应”导致;（3）在上述优化条件下,经点击化学反应后,测到目的复合物信号,经LC-MS/MS检测确证得到FKBP12F36V。泛素化修饰在生物体内广泛存在,具有重要生理功能。通过构建双功能泛素,利用泛素与靶蛋白共价结合的特性,初步建立了一种新型钓靶方法——Tr LUTI。另外,通过改变双功能泛素上赖氨酸残基,可以研究底物蛋白的降解机制,为理解蛋白质降解调控奠定基础。
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