研究背景：乳腺癌是目前威胁妇女生命健康常见的恶性肿瘤之一。我国是乳腺癌发病率增长较快的国家之一,中国抗癌协会公布的统计数字显示,我国近年来乳癌发病率正以每年3%的速度增加,成为城市中死亡率增长较快的肿瘤；除此之外,患者的发病年龄呈逐渐年轻化的趋势。尽管治疗上近几年取得较大的进展,但是仍然有较多的患者在治疗中(后)出现转移、复发。因此深入研究乳腺癌的发病机制,寻找更有效治疗乳腺癌的方法是必要的。化疗作为治疗乳腺癌的重要手段,但在治疗的同时,其副作用也是不容忽视的。例如：骨髓抑制,消化道反应,免疫功能降低,抗感染能力下降,皮肤、粘膜损害,神经系统的损伤等,当患者不能耐受时,将严重影响治疗效果。对于放疗,无论是术前放疗或术后放疗均可降低局部复发率和提高总生存率；在乳腺癌综合治疗过程中,放射治疗已经成为治疗肿瘤的重要手段。但在临床应用中多种因素会影响放疗的效果。包括肿瘤细胞本身的放射敏感性以及肿瘤对放射线的抵抗,而肿瘤周边正常组织又限制了放射剂量的增加,严重影响放疗的疗效。因此如何克服肿瘤的放射抗性,提高肿瘤的放射敏感性已成为人们关注和研究的课题。目前使用放射增敏剂来提高放疗效果已经成为研究的热点。放射增敏剂是指通过应用化学或生物手段来增加肿瘤细胞对放疗的敏感性.但同时又不明显增加对正常组织的毒性,一个理想的放射增敏剂,应当满足以下六点要求：①对正常组织细胞不增敏,但能对肿瘤细胞增敏；②对正常组织无毒性或毒性很小；③具有理想的脂水分配系统,能透入肿瘤细胞或乏氧区,不分布或少量分布到易引起毒性反应的正常组织部位；④化学性质较稳定,生物半衰期适当；⑤在整个细胞的周期中都有效；⑥治疗中,较低的药物剂量即可起到放射增敏作用。紫杉醇是从紫衫(红豆杉)树皮中提取的一种抗癌药,是红豆杉属植物中的一种复杂的次生代谢产物,也是目前所了解的惟一一种可以促进微管聚合和稳定已聚合微管的药物。同位素示踪表明,紫杉醇只结合到聚合的微管上,不与未聚合的微管蛋白二聚体反应。接触紫杉醇后,细胞内会积累大量的微管,这些微管的聚集干扰了细胞功能,特别是使细胞分裂停止于有丝分裂期,阻断了细胞的正常分裂。紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌,对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也具有一定疗效；但存在明显剂量限制性毒性,给临床应用带来一定的局限性。棉酚(gossypol)系存在于锦葵科棉属植物棉花的种子、叶、茎及根部等器官中的一种含量较高的黄色多元酚类化合物,是Bcl-2的小分子抑制剂。研究表明,棉酚的活性成分是左旋棉酚,其主要作用于Bcl-2/Bcl-xl基因,阻止其与促凋亡基因如Bak、Bax、Bad等结合形成异源二聚体,从而引起肿瘤细胞发生凋亡在体内和体外实验中,棉酚均表现出有效的抗肿瘤活性。Apogossypolone (ApoG2)是棉酚的一种新型衍生物,其毒性低,副作用小,肿瘤杀伤效果好。对肿瘤细胞生长的抑制作用较左旋棉酚强,显示出更好的发展前景。本研究以人乳腺癌MCF-7细胞系为对象,研究ApoG2与放疗,化疗联合的协同效应,并探讨可能的作用机制,为乳腺癌治疗提供一些新的研究方向。研究目的：本实验以高表达Bcl-2的乳腺癌细胞株MCF-7为对象,研究ApoG2对人乳腺癌细胞系MCF-7的放射增敏作用,及与紫杉醇联合应用的协同效应,并初步探讨其可能的作用机制,为ApoG2的进一步研究及临床应用提供实验依据,奠定理论基础。实验方法：1.采用MTT体外增殖法研究ApoG2,单纯照射组及两者联合作用72h对乳腺癌细胞系MCF-7的体外增殖抑制作用,并计算q值大小；2.MTT法检测紫杉醇、ApoG2单药及两者联合作用48h对MCF-7细胞的毒性,并计算CDI(两药相互作用指数)；3.采用平板克隆形成分析法计算各组细胞存活分数SF,通过“多靶单击数学模型”拟合细胞存活曲线,并观察(2、4、6、8Gy)单纯照射及(2.5、5μmol/L)ApoG2+(2、4、6、8Gy)照射组对肿瘤细胞的杀伤作用；4.放射敏感性实验细胞分组1：(对照组、5u mol/LApoG2组、8Gy射线组、5μmol/LApoG2+8Gy射线组),化疗敏感性实验细胞分组2：(对照组、10μmol/LApoG2组、0.25μ mol/紫杉醇组、10μmol/LApoG2+0.25μmol/L紫杉醇组)。用Hoechst33258荧光染色法及A0荧光染色法观察MCF-7细胞在上述分组处理作用48h后引起的凋亡和自噬形态学的变化；5.流式细胞仪分析经上述分组处理的MCF-7细胞的凋亡率及自噬荧光强度变化；6. Western blot法检测经上述分组处理的MCF-7细胞Bcl-2蛋白及Beclinl蛋白表达变化。实验结果：1.通过MTT体外增殖实验检测提示ApoG2、射线对MCF-7细胞系分别作用72h后具有生长增殖抑制作用(FApoG2=197.338,P=0.000；F射线=647.817,P=0.000),两者联合作用72h后,抑制率随着药物浓度及射线剂量的增加逐渐增强,两者之间存在交互效应(F=15.200,P=0.000)。通过计算q>1.15,ApoG2与射线联合应用具有协同作用。不同浓度ApoG2、紫杉醇对MCF-7细胞分别作用48h后具有生长抑制作用(FApoG2=156.916,P=0.000；Fpaclitaxel=129.904,P=0.000),两者联合作用48h后,抑制率随着两者药物浓度的增加逐渐增强,两者之间存在交互效应(F=12.402,P=0.000)。通过计算CDI<1,ApoG2与紫杉醇联合应用具有协同效应。2.平板克隆实验表明,经射线(2,4,6,8Gy)、(2.5,5μ mol/L)ApoG2+射线(2,4,6,8Gy)作用于乳腺癌细胞MCF-7细胞2周后,单纯照射组、2.5μ mol/L+照射组和5u mol/L+照射组的细胞存活率随着射线剂量的增加逐渐降低,差异具有统计学意义(F单纯照射=264.308,P单纯照射=0.000；F2.5μmol/L+照射=180.204,P2.5μmol/L照射=0.000；F5μmoL+照射=214.737,P5μmol/L=0.000)。通过单击多靶模型拟合曲线显示：单纯照射组Do、Dq分别为1.925,3.564Gy,2.5μmol/LApoG2+照射组Do、Dq、SER(Do值比)、SER(Dq值比)分别为1.688Gy,2.123Gy,1.140,1.679,51μmol/LApoG2+照射组Do、Dq、SER(Do值比)、SER(Dq值比)分别为1.317Gy,1.675Gy,1.462,2.128。低浓度的ApoG2作用后Do、Dq均低于对照组。实验组曲线低剂量区“肩区”明显缩小变窄,且各剂量点的存活分数均低于对照组,提示细胞亚致死性放射损伤修复能力降低。3.Hoechst33258荧光染色法可见5μ mol/LApoG2、8Gy射线及两者联合作用于MCF-7细胞48h,1Oμmol/LApoG2、0.25μmol/紫杉醇及两者联合作用48h后,荧光显微镜下可见核固缩、碎裂,染色质凝集、凋亡小体形成等凋亡现象；而对照组细胞则呈现弥散均匀,淡蓝色的正常细胞核。ApoG2与紫杉醇联合作用组较单独处理组凋亡现象更明显,而ApoG2与射线联合组较单独处理组比较凋亡现象未见明显增加；AO(吖啶橙)荧光染色法可见对照组细胞胞浆或胞核染成亮绿色荧光,处理组胞浆或胞核可见亮红色荧光,为酸性自噬泡,联合作用组较单独处理组自噬现象更明显。4.流式细胞检测技术可见5μ mol/LApoG2,8Gy射线及两者联合作用于MCF-7细胞48h后,不同处理组凋亡率差异具有统计学意义(F=35.074,P=-0.000)；不同处理组自噬荧光强度差异具有统计学意义(F=470.809,P=0.000)。联合作用组细胞自噬荧光强度较单独处理组升高(P<0.05),但联合作用组凋亡率较单独处理组并不都具有统计学意义。10μmol/LApoG2,0.25μ mol/L紫杉醇及两者联合作用于MCF-7细胞48h后,不同处理组凋亡率差异具有统计学意义(F=571.563,P=O.000)；不同处理组自噬荧光强度差异具有统计学意义(F=204.422,P=0.000)。联合作用组细胞凋亡率和自噬荧光强度均较单独处理组升高(P<0.05)。5. Western blot检测结果提示5μ mol/LApoG2,8Gy射线及两者联合作用于MCF-7细胞48h后,不同处理组Beclinl,Bcl-2蛋白表达差异具有统计学意义(FBeclinl=176.562,PBeclinl=0.000；FBcl-2=7470.809,PBcl-2=0.000)；两者联合作用组Beclinl蛋白表达较单独处理组升高(P<0.05),Bcl-2蛋白表达较单独处理组降低(P<0.05)。10μmol/LApoG2,0.25μ mol/L紫杉醇及两者联合作用于MCF-7细胞48h后,不同处理组Beclinl,Bcl-2蛋白表达差异具有统计学意义(FBeclinl=57.266,PBeclinl=0.000；FBcl-2=138.495,PBcl-2=0.000)；两者联合作用组Beclinl蛋白表达较单独处理组升高(P<0.05),Bcl-2蛋白表达较单独处理组降低(P<0.05)。实验结论：ApoG2能够增加人乳腺癌细胞系MCF-7对放射的敏感性,还可以提高紫杉醇对MCF-7细胞杀伤效应。其机制可能与ApoG2诱导癌细胞凋亡和自噬有关；自噬可能在增加放射敏感性方面起着重要作用,而在增加紫杉醇化疗敏感性中,自噬和凋亡协同发挥抑制肿瘤细胞生长的作用。