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口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的一种高度接触性传染病,能够造成重大的经济损失和不良的政治影响。本研究以FMDV A型AF/72毒株为材料,利用昆虫杆状病毒表达系统,构筑FMDV A型的病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),为FMD疫苗研究提供新策略。1、本研究完成了FMDV A型AF/72株衣壳蛋白P12A与蛋白酶3C基因的克隆,并将其连接到p MD19-T载体上进行测序。对衣壳蛋白P12A与蛋白酶3C基因进行序列分析,发现FMDV A型AF/72株的P1结构编码区全长为2211bp,编码737aa。编码的4种结构蛋白分别为VP4 255bp(85aa)、VP2 654bp(218aa)、VP3 663bp(221aa)和VP1 639bp(213aa)。2A基因全长48bp,编码16aa。3C基因全长639bp,编码213aa。2、本研究采用两种不同的策略来研究FMDV A型AF/72株VLPs的组装。一是通过限制性酶切位点将P12A和3C基因串联插入到杆状病毒表达载体p Fast BacTMHTB中,研究目的基因的表达。二是将P12A和3C基因插入到带有双启动子(Pp10和PPH)的杆状病毒表达载体p Fast BacTMDual中,探讨目的基因的表达和VLPs的组装。将携带P12A和3C基因的两种杆状病毒表达载体分别转化E.coli DH10感受态细胞进行蓝白斑筛选,将鉴定正确的重组杆状病毒质粒转染Sf9细胞后收获重组杆状病毒Bacmid-HTB-P12A3C与Bacmid-Dual-P12A3C。Western bloting检测结果表明只有感染Bacmid-Dual-P12A3C的Sf9细胞表达的蛋白P12A能够被蛋白酶3C切割,显示出81KD(P12A)、57KD(VP0+VP3)、47KD(VP3+VP1)、33KD(VP0)和24KD(VP1/VP3)五条蛋白条带;而感染Bacmid-HTB-P12A3C的Sf9细胞只检测到P12A条带。电子显微镜下观察,只有感染重组杆状病毒Bacmid-Dual-P12A3C的实验组形成了30nm左右的VLPs。3、本研究将重组杆状病毒Bacmid-HTB-P12A3C和Bacmid-Dual-P12A3C感染细胞后的表达产物经蔗糖密度梯度离心粗提纯化后与佐剂ISA206乳化成疫苗免疫豚鼠,进行免疫原性分析。结果表明两个实验组和疫苗阳性对照组都能够引起豚鼠产生较高水平的针对FMDV的特异性抗体和中和抗体。细胞免疫检测表明,实验组和疫苗组中像IL-4等细胞因子水平都有显著的提高。