第一部分细胞周期调控对大鼠脊髓损伤后炎性反应的影响及其机制研究目的:小胶质细胞作为CNS组织内主要的免疫细胞,在脊髓损伤后被大量激活并释放多种致炎细胞因子而加重机体的炎性损伤,并促进神经元细胞的凋亡。由于小胶质细胞为可分裂细胞,其活化增殖受着细胞周期的密切调控。本部分研究试图探讨细胞周期抑制剂olomoucine对脊髓损伤后小胶质细胞的活化增殖及相关炎症反应的影响,为细胞周期调控在CNS的进一步研究应用提供实验依据。方法:实验动物分为假手术组、脊髓损伤组和olomoucine干预组,建立脊髓半切损伤模型,分别于损伤后3h、6h、24h、3d、7d处死,剥离受损节段脊髓计算组织含水量,利用免疫组织化学技术检测脊髓损伤后小胶质细胞的活化增殖情况,利用TUNEL技术检测神经元凋亡变化,利用western blot技术检测细胞周期相关蛋白(cyclin A, cyclin B、cyclin E以及PCNA)和致炎因子IL-1β的表达水平变化。结果:假手术组中细胞周期相关蛋白的表达较弱,小胶质细胞多处于静息状态,神经元凋亡数目少;脊髓损伤后细胞周期相关蛋白的表达显著升高,小胶质细胞明显活化增殖,其增殖指数为85±9%,并产生大量的致炎因子IL-1β,损伤后脊髓组织水肿明显,含水量可达70.18±0.34%,神经元的凋亡数目也显著增多;给予olomoucine干预后细胞周期相关蛋白的表达明显降低,小胶质细胞的活化增殖被显著抑制,增殖指数降至27±3%,IL-1β的表达水平显著降低,组织含水量也明显减轻,降为68.76±0.23%,神经元凋亡较损伤组明显降低(p<0.05)。结论:CDK抑制剂olomoucine可通过降低脊髓损伤后细胞周期相关蛋白的表达,进而抑制小胶质细胞的活化增殖和相关致炎因子的产生,减轻组织水肿的形成,并减少神经元凋亡,提示细胞周期调控可能是未来脊髓损伤治疗的一个新的举措。第二部分细胞周期调控对大鼠脊髓损伤后反应性星形胶质增生的影响及其机制研究目的:成年哺乳动物脊髓损伤后轴突往往不能有效再生,而造成不可逆性的神经功能缺损。有研究认为,CNS损伤后形成的胶质瘢痕以及其分泌的以硫酸软骨素蛋白多糖(chondroitin sulfateproteoglycans,CSPGs)为主的再生抑制因子形成了阻碍轴突生长的重要的物理和化学屏障,从而影响了机体的结构重建和功能恢复。由于胶质细胞的活化增殖受着细胞周期的密切调控,本部分内容试图研究细胞周期抑制剂olomoucine对大鼠脊髓损伤后星形胶质细胞的活化增殖和相关再生抑制因子产生的影响,并探讨细胞周期调控对SCI后轴突再生、结构重建和功能恢复的可能作用机制。方法:实验动物分为假手术组,脊髓损伤组和olomoucine干预组,建立脊髓半切损伤模型,分别于损伤后7d、28d、56d处死,采用免疫组织化学技术检测脊髓损伤后7d时星形胶质细胞的活化增殖情况和28d时CSPG以及生长相关蛋白(growth associated protein-43, GAP-43)的表达情况,通过western blot技术检测GAP-43的表达水平变化,利用HE染色观察损伤后空洞灶大小,采用改良CBS评分评估各实验组动物运动功能。结果:假手术组中星形胶质细胞多处于静息状态,形态纤细,胞体较小,GFAP和CSPG表达较弱,GAP-43表达水平也较低;损伤后星形胶质细胞明显活化增殖,7d时增殖指数为35±5.2%,SCI 28d后损伤区形成空洞,最大横截面积为2.4±0.3mm2,周边环绕致密的胶质瘢痕,瘢痕中GFAP和CSPG表达较强,此外损伤组GAP-43的表达较假手术组也有所升高;olomoucine干预组7d时星形胶质细胞的增殖指数降至14±2.3%,损伤面积缩小为1.1±0.2mm2,损伤灶周GFAP和CSPG的表达明显减弱,GAP-43的表达较损伤组显著增强,运动功能评估也较损伤组明显改善(P<0.05)。结论:细胞周期抑制剂olomoucine可通过抑制脊髓损伤后星形胶质细胞的活化增殖和再生抑制性因子CSPG的产生,改善受损轴突的再生微环境,促进机体的结构重建和功能恢复。本研究为CNS损伤后治疗提供了一个新思路。第三部分大鼠脊髓损伤后小胶质细胞活化增殖与反应性星形胶质增生的关系研究目的:小胶质细胞的活化增殖和反应性星形胶质增生(reactive astrogliosis)是脊髓损伤后两种常见的病理现象,两者之间可能有着密切的联系,然而小胶质细胞-星形胶质细胞间的相互作用及可能的分子机制目前所知甚少。我们前面的研究已经阐明,脊髓损伤后持续应用细胞周期抑制剂olomoucine不仅可以有效抑制小胶质细胞的活化增殖和相关致炎因子的产生,并减少神经元的凋亡,而且可以抑制星形胶质细胞的增殖,减轻胶质瘢痕的形成和轴突再生抑制因子的产生,缩小损伤空洞的大小,最终改善机体运动功能。本部分研究中我们试图通过细胞周期调控的方式探讨脊髓损伤后小胶质细胞的活化增殖和反应性星形胶质增生的相互关系及其可能的作用机制。方法:实验动物分为假手术组,脊髓损伤组和olomoucine干预组,建立脊髓半切损伤模型,分别于损伤后1d、3d、7d、14d、28d处死,利用免疫组织化学技术检测脊髓损伤后1d和3d时小胶质细胞的活化增殖和星形胶质细胞的活化情况,通过免疫组化、RT-PCR和western blot技术观察SCI后3d、7d、14d、28d等时间点GFAP免疫强度、mRNA和蛋白表达水平的动态变化趋势。结果:我们研究发现,小胶质细胞于损伤后1d时即被明显激活,3d时其活化增殖达到高峰;而星形胶质细胞3d时才有所活化,7d时更为明显,至损伤后14d时达到活化增殖的高峰,说明SCI后小胶质细胞的活化增殖现象要先于反应性星形胶质增生的出现,损伤后GFAP的mRNA和蛋白水平的表达增高均出现于小胶质细胞活化增殖之后。损伤30min后给予一次olomocine腹腔注射(相对选择性地抑制早期出现的小胶质细胞活化增殖),可以有效降低损伤后1周、2周和4周时的GFAP mRNA和蛋白水平的表达,提示早期的小胶质细胞的活化增殖在后续的反应性胶质增生现象中可能起着重要的作用。结论:结合以前的研究结果,我们认为,早期小胶质细胞的活化增殖通过产生大量的致炎因子,可能对后期的反应性胶质增生起着促进和维持的作用。