鸡球虫病是由艾美耳属的一种或数种球虫同时或先后寄生于鸡肠道上皮细胞而引起的,可导致养鸡业发生巨大经济损失的寄生虫病。实践证明,抗球虫药物使用在鸡球虫病的防治上具有重要作用。但球虫抗药性问题限制了现有抗球虫药物的有效应用,促使人们不得不寻找新的药物靶标。鸡球虫的Ⅱ型脂肪酸合成代谢途径(type Ⅱ fatty acid biosynthesis pathway, FAS Ⅱ)是一种植物样的特殊代谢途径,是研制开发新型抗球虫药物的一个潜在靶位。本实验主要研究EtFAS Ⅱ途径中脂酰链延伸第三步反应过程中起作用的β-羟酰-ACP脱水酶(β-hydrdoxyacyl-ACP dehydrase, HAD)的生化特征,HAD主要催化β-羟酰-ACP脱水生成反-2-烯酰-ACP。本论文首先通过生物信息学方法对柔嫩艾美耳球虫(E.tenalla)β-羟酰-ACP脱水酶基因(Ethad)进行预测,以柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子总RNA为模板,用RT-PCR方法成功扩增出长484bp的EtHAD基因部分片段。其编码的氨基酸序列与其它物种HAD的相似性在30-70%之间,具有两个保守的活性位点"His",“Glu"和5个保守基序91notif)("PHRYPFLLVD"、"GHFP"、"PGVL"、"EALAQ"和"PGD")。预测的三级结构显示,与其它物种的HAD具有相同的活性中心。扩增的成熟片段克隆到原核表达载体pET-32a(+),利用E.coli Rosseta(DE3)重组表达系统表达EtHAD的成熟基因片段。培养物37℃培养,当OD600达到0.6时,加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导,16℃培养12h后发现有大量可溶性表达,并利用Ni-NTA进行纯化。纯化pET-32a(+)-EtHAD表达的重组蛋白,制备抗体,利用荧光免疫标记技术研究EtHAD在E.tenella子孢子内的亚细胞定位。结果显示,EtHAD定位于E.tenella子孢子的顶质体。以丁烯酰-ACP的相类似物丁烯酰-CoA作为底物,进行酶动力学分析,通过底物在紫外光(260nm)吸收的减少来测定反应速率,测得HAD对丁烯酰-CoA的Km值为79.4+2.96μM,Vmax为0.06985nM/min/μg。抑制动力学分析,发现儿茶素没食子酸酯((-)-catechin gallates)、5-羟基-1,4-萘醌(胡桃醌)(Juglone)对EtHAD有一定的抑制作用,其IC50分别为10.5±0.6μM和35.4±1.0μM。提示EtHAD有可能成为开发新抗球虫药的靶标。