一、背景　　 实体恶性肿瘤生长必需依赖血管生成。作为实体恶性肿瘤之一的骨肉瘤，是典型的富含血管的恶性肿瘤。血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cell，EPCs)是血管内皮细胞的前体细胞，可增殖、移行、分化为血管内皮细胞。而血管生成(angiogenesis)，涉及到EPCs迁移、募集、分化为内皮细胞，参与原始毛细血管的形成。肿瘤细胞分泌的一些细胞因子和趋化因子参与EPCs向肿瘤组织募集、分化，促进EPCs在肿瘤部位的血管生成。这些来源于EPCs的成熟内皮细胞又可继续增殖重塑产生新的血管。而EPCs在细胞因子作用下向肿瘤组织特异性募集、趋化，参与肿瘤血管形成这一特性为抗肿瘤血管发生提供了新思路。只要能够阻断EPCs募集、分化过程中的任何一个环节，就可以阻止EPCs对肿瘤血管的生成促进作用，达到治疗肿瘤的目的。因此抑制EPCs募集分化，即从源头上阻滞肿瘤血管形成，对于抗肿瘤血管治疗具有重要意义。　　 二、目的　　 本课题拟采用细胞和分子生物学等方法，观察给予蜂毒素对EPCs增殖、迁移、黏附和成小管等能力的影响，有望找出蜂毒素阻断骨肉瘤血管新生的作用机制；根据骨肉瘤侵犯骨髓的特点，采用裸鼠胫骨原位移植瘤模型，更好的模拟骨肉瘤在人体内的生物学状态及观察蜂毒素对裸鼠体内骨肉瘤诱导的EPCs的影响，为阐明蜂毒素抑制骨肉瘤血管生成的作用机理提供实验依据。　　 三、方法　　 第一部分：鼠骨髓来源的内皮祖细胞的原代分离、培养和鉴定　　 1.雄性4周龄SD大鼠，无菌条件下取股骨和胫骨，收集冲洗出来的骨髓，利用密度梯度离心法获取单个核细胞群。将单个核细胞群接种在包被有鼠纤维连接蛋白的培养板中培养4d，洗掉非贴壁细胞，换培养液继续培养，待细胞融合约80％时进行消化、传代。　　 2.细胞爬片，分别加入兔抗鼠单克隆抗体CD34、CD133，用牛血清白蛋白做空白对照。滴加与第一抗体种属匹配的荧光素标记二抗，DAB显色剂显色，中性树脂封片。荧光显微镜下观察拍照。CD34阳性细胞呈现绿色荧光，CD133阳性细胞呈现红色荧光，CD34/CD133双阳性细胞呈现橙黄色荧光。　　 第二部分：蜂毒素体外抑制内皮祖细胞形成血管及其机制研究　　 1.蜂毒素体外抑制内皮祖细胞增殖、迁移、黏附、小管形成的实验研究：分别通过MTT比色法、Transwell小室迁移模型、黏附实验和三维小管形成实验观察蜂毒素对EPCs的影响。　　 2.蜂毒素体外抑制内皮祖细胞形成血管的机制研究：通过Western Blot检测法、图象分析定量等方法，检测蜂毒素对EPCs形成血管相关的VEGFR1、VEGFR2、CXCR4、SDF-1α、α5β1、αvβ5等蛋白及与磷酸化有关的P-AKT、AKT、P-ERK1/2、ERK1/2等蛋白的影响。　　 第三部分：蜂毒素体内抑制内皮祖细胞形成血管及其机制研究　　 1.建立裸鼠荷UMR-106成骨肉瘤胫骨原位移植动物模型，肿瘤直径长至0.5cm左右，随机分5组：生理盐水组、蜂毒素低剂量组(160μg/kg/d)、蜂毒素中剂量组(320μg/kg/d)、蜂毒素高剂量组(1600μg/kg/d)、TNP-470组(3mg/kg/d)，一天一次局部注射给药，给药10天。给药结束次日处死裸鼠。测量移植瘤长径、短径并称瘤重，计算体积抑瘤率和重量抑瘤率。　　 2.瘤体组织采用免疫组织化学染色法和免疫荧光染色法染色，Western Blot法、图象分析定量等方法，检测蜂毒素对骨肉瘤组织中微血管密度(MVD)、EPCs的数量和其形成血管相关的VEGFR1、VEGFR2、CXCR4、SDF-1α、α5β1、αvβ5等蛋白及与磷酸化有关的P-AKT、AKT、P-ERK1/2、ERK1/2等蛋白的影响。　　 四、结果　　 第一部分：大鼠骨髓来源的内皮祖细胞的原代分离、培养和鉴定　　 结果显示：　　 1.在倒置显微镜下可见经VEGF和bFGF诱导培养24h后的部分细胞开始贴壁、变大。第14天左右，出现集落样结构和铺路石样结构。集落中央为圆形细胞群，周边有梭形细胞不断生成，呈放射状，与原始血岛相似。　　 2.细胞免疫荧光染色法染色EPCs，免疫荧光显微镜下观察拍照显示，所培养的细胞同时表达CD34(绿色荧光)和CD133(红色荧光)，即CD34/CD133双阳性细胞呈现橙黄色荧光，该表型符合EPCs的表型特征。　　 第二部分：蜂毒素体外抑制内皮祖细胞形成血管及其机制研究　　 1.蜂毒素体外抑制内皮祖细胞增殖、迁移、黏附、小管形成的实验研究　　 MTT结果显示，蜂毒素能显著抑制EPCs的生长增殖，具有显著浓度依赖性。24h、48h和72h的IC50分别为3.51μg/ml、2.33μg/ml和2.01μg/ml。Transwell小室趋化实验结果显示，蜂毒素在浓度2μg/ml～8μg/ml范围内，随着浓度增加，EPCs迁移数目明显减少，因此蜂毒素对EPCs迁移具有显著抑制作用，且呈现浓度依赖效应，与空白对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。黏附实验结果显示，光镜下观察蜂毒素2μg/ml，4μg/ml和8μg/ml浓度组贴壁细胞数目逐渐减少，明显低于空白对照组，因此蜂毒素对EPCs黏附具有显著抑制作用，与空白对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。小管形成实验结果显示，蜂毒素各浓度组管状结构面积均低于空白对照组，因此蜂毒素对EPCs管状结构形成具有显著抑制作用，且呈现浓度依赖效应，与空白对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。　　 2.蜂毒素体外抑制内皮祖细胞形成血管的机制研究　　 Western blot检测结果显示，蜂毒素组的VEGFR2、CXCR4、SDF-1α、α5β1、αvβ5、P-AKT、P-ERK1/2等蛋白条带灰度值明显低于VEGF、SDF-1α、FN等组，说明蜂毒素可以抑制VEGF、SDF-1α、FN等诱导激活的EPCs磷酸化蛋白和下调相应的受体表达。　　 第三部分：蜂毒素体内抑制内皮祖细胞形成血管及其机制研究　　 1.蜂毒素对骨肉瘤裸鼠胫骨移植瘤生长的抑制作用及裸鼠胫骨移植瘤内EPCs募集影响的实验研究　　 实验结果显示，蜂毒素低、中剂量组裸鼠胫骨骨肉瘤体积减小，与生理盐水组比较具有统计学意义(P＜0.01)。蜂毒素高剂量组和TNP-470组对骨肉瘤体积抑制效果更加明显，与生理盐水组比较，均具有统计学意义(P＜0.001)。蜂毒素低、中剂量组裸鼠胫骨骨肉瘤体重量减小，与生理盐水组比较具有统计学意义(P＜0.05)。蜂毒素高剂量组和TNP-470组对骨肉瘤体重量抑制效果更加明显，与生理盐水组比较，均具有统计学意义(P＜0.001)。蜂毒素各组及TNP-470组均可明显减少肿瘤组织中CD34/CD133双阳性细胞的数量，与阴性对照组比较，差异有显著性(P＜0.05)；蜂毒素低、中剂量组与蜂毒素高剂量组比较，差异有显著性(P＜0.05)。　　 2.蜂毒素体内抑制内皮祖细胞形成血管的机制研究　　 肿瘤MVD计数结果显示，蜂毒素各剂量组均可抑制肿瘤组织MVD，与生理盐水组比较，差异有显著性(P＜0.05)；蜂毒素低、中量组与TNP-470组比较，差异有显著性(P＜0.05)；蜂毒素各组间比较，差异有显著性(P＜0.05)。免疫组织化学染色法检测结果显示，蜂毒素各组可下调VEGFR2、CXCR4、SDF-1α、α5β1、αvβ5等蛋白的表达，与生理盐水组比较，差异有显著性(P＜0.05)。　　 五、结论　　 1.以往UMR-106细胞骨肉瘤移植瘤模型，都以SD大鼠为造模对象，且大多数是皮下瘤模型，成瘤率低，瘤体生长不稳定。我们改用裸鼠胫骨原位建立移植瘤模型，成瘤率高，几乎达100%，瘤体生长稳定。因此裸鼠胫骨原位移植瘤模型，是比较成熟的造模方式，适合于有关于骨肉瘤的动物实验研究。　　 2.蜂毒素对UMR-106成骨肉瘤细胞裸鼠胫骨移植瘤的生长和瘤体内微血管密度具有显著的抑制作用。　　 3.首次发现体内蜂毒素对骨肉瘤体内募集的EPCs数量有明显的抑制作用。　　 4.从体、内外角度研究蜂毒素，我们发现其可以抑制内皮祖细胞的增殖、迁移、黏附、管状结构形成等能力，机制可能与其能阻断内皮祖细胞胞内的磷酸化作用和下调VEGFR2、CXCR4、SDF-1α、α5β1、αvβ5等蛋白有关，该发现，国内外尚未见报导。