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第一部分硼替佐米预处理对MIRI的作用背景:心肌缺血再灌注损伤(MIRI)是临床上经历再灌注治疗措施的急性心肌梗死患者面临的主要风险事件,寻找再灌注损伤的治疗靶点已成为改善患者预后、提高生存率的重要研究方向之一。已有多种蛋白酶体抑制剂(PIs)被报道可改善MIRI。硼替佐米(Bor)是一种新型高选择性PI,但其在MIRI中的具体作用及分子机制目前尚不明确。结合前期研究报道PIs在不同剂量下对细胞存在差异性的作用,本部分研究旨在探索Bor预处理对MIRI的作用。方法:体外培养小鼠心房心肌细胞系HL-1并建立细胞缺氧复氧(H/R)模型模拟心肌细胞MIRI损伤。在细胞培养基中分别添加三种浓度10,50和100 n M的Bor,预处理24h后再给予H/R处理进行造模。使用(乳酸脱氢酶)LDH细胞毒性检测试剂盒检测各H/R细胞模型的培养上清中LDH释放水平,用LDH释放水平来评估细胞损伤程度。同时,通过C57BL/6小鼠左前降支冠状动脉(LAD)短暂性缺血30 min的方法建立小鼠MIRI模型,分别探索Bor在缺血前0 h和缺血前2 h两个给药时间点和0.1 mg/kg和0.5 mg/kg两个浓度下对MIRI的影响。在再灌注24h后利用超声心动图检测小鼠心功能,通过左室射血分数(LVEF)和左室缩短分数(LVFS)的变化来评估不同处理组小鼠心功能的改变。利用心脏切片苏木素伊红(HE)染色和髓过氧化物酶(MPO)染色评估在再灌注24h后不同处理组小鼠心脏组织损伤和炎症反应程度。利用Evans蓝/TTC染色和血清肌钙蛋白T检测试剂盒检测不同处理组小鼠在再灌注24h后的梗死面积和心脏损伤指标变化。利用蛋白酶体20S检测试剂盒检测Bor给药后各处理组小鼠心脏裂解液中20S的变化情况。结果:细胞实验结果显示,当Bor预处理浓度为10 n M和50 n M时,缺氧6小时/复氧18小时(H6R18)和缺氧6小时/复氧24小时(H6R24)组细胞死亡率与PBS组相比均显著下降。当Bor预处理浓度为100 n M时,Bor可显著降低H6R18组细胞死亡率,但对H6R24组细胞死亡率没有明显影响。动物实验结果显示,Bor在缺血前2 h给药且给药浓度为0.5 mg/kg时,与control组相比,显著提高小鼠LVEF和LVFS,改善小鼠左心收缩功能,减轻MIRI后心肌细胞损伤和炎症反应程度。有趣的是,Bor在缺血前0 h给药且给药浓度为0.5 mg/kg时,与control组相比,显著降低小鼠LVEF和LVFS,影响小鼠左心收缩功能,加重MIRI后心肌细胞损伤和炎症反应程度。进一步地,以0.5 mg/kg的浓度在MIRI手术前2 h给予Bor预处理的小鼠,心肌梗死面积和心脏损伤标志物水平与control组相比均显著改善,且心脏20S蛋白酶体活性与control组相比得到了显著的抑制。以0.1 mg/kg浓度给药时,MIRI手术前2 h和0 h给药组小鼠左室收缩功能与control组相比均无明显差异。结论:Bor在不同浓度和预处理时间下对MIRI的作用不同。Bor在MIRI造模前2 h给药且给药浓度为0.5 mg/kg时,可显著改善MIRI损伤,但在MIRI造模前0 h给药且给药浓度为0.5 mg/kg时,Bor可显著加重MIRI损伤。第二部分硼替佐米改善MIRI机制的初步探索背景:在急性心肌梗死(AMI)后的再灌注过程中,氧化应激反应会严重损害心脏。对再灌注相关氧化应激损伤的干预已成为MIRI后心肌保护的重要研究方向。核因子E2相关因子2(Nrf2)作为内源性抗氧化通路的重要组成部分,最近有研究报道其可能参与了PIs对氧化应激相关疾病的保护作用。在上一部分的研究中,我们发现在MIRI手术前2 h以0.5 mg/kg的浓度给予Bor可发挥对MIRI的保护作用,但其发挥保护作用的具体机制目前尚无报道。结合前期研究,本部分旨在探索Bor在MIRI中发挥保护作用的分子机制。方法:通过C57BL/6小鼠LAD短暂性缺血30 min的方法建立小鼠MIRI模型,在MIRI造模前2 h腹腔注射0.5 mg/kg的Bor,分别利用二氢乙啶(DHE)探针检测心脏活性氧(ROS)释放水平,生化试剂盒检测心脏组织谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)表达水平,Western Blot检测心脏组织超氧化物歧化酶1(SOD1),过氧化氢酶(CAT),Nrf2和血红素加氧酶1(HO-1)蛋白表达变化以评价不同处理组小鼠在再灌注3h后的氧化应激损伤程度;在MIRI造模前给予Nrf2的抑制剂ML-385,检测腹腔注射Bor后各指标的表达变化。结果:与control组相比,Bor组小鼠在MIRI造模后心脏组织ROS水平显著降低,GSH显著增高,MDA显著下降,SOD1、CAT显著增高。与control组相比,Bor预处理组小鼠心脏组织核内Nrf2蛋白水平显著升高,HO-1蛋白水平显著升高;Bor组小鼠给予Nrf2抑制剂ML-385后,与单纯Bor给药组相比,其核内Nrf2蛋白水平显著下降,HO-1蛋白水平显著下降,GSH水平显著降低,MDA水平显著升高。结论:Bor在MIRI造模前2 h给药且给药浓度为0.5 mg/kg时,可显著改善MIRI后氧化应激反应,Bor对MIRI的保护作用至少部分是通过激活Nrf2/HO-1抗氧化通路实现的。