青钱柳化学成分分离、网络药理学和三萜类化合物合成通路研究

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青钱柳[Cyclocarya paliurus(Batal)Iljinsk]是我国特有的植物,集用材、绿化、保健、药用于一身。青钱柳叶片为新资源食品,制茶作饮料具有清热解暑、降血压以及延年益寿等功效。三萜和黄酮是青钱柳叶中重要的活性成分之一,具有多种的生物活性,如降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗菌、抗氧化等。目前中国糖尿病(diabetes mellitus,DM)和癌症(Cancer)患病人数正在逐年增长。对于青钱柳叶片提取物如何治疗糖尿病和肝癌的潜在作用机制,相关研究涉及较少。本论文以青钱柳叶片为研究对象,提取化合物并鉴定结构;利用转录组学确定三萜类化合物的合成通路,采用网络药理学探究青钱柳叶片黄酮以及三萜活性成分对糖尿病和肝癌的潜在作用机制,预测可能的目标化合物,为青钱柳治疗糖尿病和肝癌提供理论依据。主要研究结果如下:(1)从青钱柳植物的提取物中共分离得到18个化合物,通过MS、1H-NMR、13C-NMR等波谱的解析和化学方法,以及参考对照文献,鉴定了这些化合物的结构。这些化合物是:5-羟基-2-甲氧基-1,4-萘醌(QQL-01)、4-Pregnene-3,20-dione(QQL-02)、熊果酸内酯(QQL-03)、槲皮素(QQL-04)、儿茶素(QQL-05)、山奈酚(QQL-06)、积雪草酸(QQL-07)、熊果酸(QQL-08)、山俞酸(QQL-09)、齐墩果酸(QQL-10)、Hederagenin(QQL-11)、β-谷甾醇(QQL-12)、香草酸(QQL-13)、柚皮素(QQL-14)、L-焦谷氨酸(QQL-15)、木犀草素(QQL-16)、没食子酸(QQL-17)、白桦脂酸(QQL-18),其中有5个黄酮类化合物,分别为QQL-04、QQL-05、QQL-06、QQL-15和QQL-17,7个三萜类化合物,分别为QQL-03、QQL-07、QQL-08、QQL-10、QQL-12、QQL-13、QQL-18。将分离得到的化合物并结合文献中所搜集的化合物筛选出黄酮类化合物和三萜类化合物进行抗肿瘤和抗糖尿病的网络药理学实验。(2)对青钱柳四个不同发育时期叶片的转录组学测序结果进行分析,发现在F1和F2时期中萜类骨架合成中发挥主要作用的是Mevalonate通路,在F3和F4时期中萜类骨架合成中发挥主要作用的是MEP通路。萜类骨架合成途径和三萜合成通路上的HMGS、FDPS、SQS和LUP酶在F1和F2时期呈现上调趋势,可能是青钱柳叶F1和F2时期合成为三萜成分的关键基因。青钱柳F3和F4时期三萜合成减少,萜类骨架合成主要受GGPS酶调控合成二萜和倍半萜。(3)使用生物信息学技术和分子对接技术对青钱柳三萜类成分抗糖尿病作用的机制进行分析。结合文献检索鉴定出的39种三萜化合物以及实验鉴定出的3种三萜化合物进行预测。总共筛选出33个作用于36条信号通路的抗糖尿病潜在靶蛋白。最后,筛选出7种化合物,15种靶蛋白和15种信号通路在青钱柳对糖尿病的治疗作用中起着重要作用。这些结果为使用青钱柳抗糖尿病的治疗提供了理论框架。此外,分子对接验证显示,当针对关键靶蛋白进行测试时,超过90%的活性成分具有结合活性,而文献检索表明,鉴定出的活性成分具有抗糖尿病作用,表明结果高度可靠。(4)通过检索中药系统药理数据分析平台和査阅文献,筛选青钱柳主要黄酮类化合物成分,并整合各成分对应靶点,结合肝癌的疾病靶点,筛选出59个交集靶点,使用David数据库对靶点进行GO和KEGG富集分析,建立成分-靶点网络(C-T)、PPi蛋白互作网络、成分-靶点-通路网络(C-T-P)。网络拓扑学结果分析得到4种核心成分可能在青钱柳治疗肝癌过程中发挥重要作用。另外预测结果得到AKT1、EGFR、ESR1等16个核心靶点是青钱柳是治疗肝癌的潜在靶蛋白。癌症通路(hsa05200)、PI3K-Akt信号通路(hsa04151)、Micro RNAs in cancer(hsa04151)和Proteoglycans in cancer(hsa05205)等多个具有与肝癌相关的靶蛋白通路可能被证明是肝癌发展的关键途径。
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