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背景：我国是HBV感染的高发区，约有9300万慢性HBV感染者。HBV感染可引起不同的临床结果，包括急性乙肝、慢性HBV携带、慢性乙肝、肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌等，其原因主要决定于机体的免疫应答状态。人体肝脏含有大量的天然免疫细胞如NK细胞(natural killer cells, NK)、 NKT(natural killer Tlymphocytes, NKT)细胞等，约占整个肝脏淋巴细胞的2/3。其中NK细胞约占30%，NKT细胞也近30%，而适应性免疫T淋巴细胞亚群仅占30%左右。穿孔素(perforin，又称pore-forming protein, PFP)是由细胞毒性细胞：NK细胞、NKT细胞及细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes, CTL)分泌的效应分子，能在靶细胞上形成跨膜的孔道，使颗粒酶进入靶细胞胞浆，由此启动凋亡信号通路，引起肝细胞损害。因此，NK细胞、NKT细胞和CTL细胞在HBV感染的清除和免疫导致病理损伤的作用需进一步明确。目的：研究慢性HBV感染患者外周血HBV特异性CTL、NK细胞、NKT细胞的频数、穿孔素量的表达，与血清丙氨酸氨基转移酶水平、HBV载量的相关性，探讨慢性HBV感染患者血HBV特异性CTL、NK细胞、NKT细胞的免疫学特点及其介导肝损伤的机制。方法：研究对象为2011年9月至2012年3月苏州大学附属第一医院感染病科门诊和住院HBV感染患者70例和健康对照者10例：其中乙肝病毒携带者15例，慢型乙型肝炎（chronic HBV hepatitis CHB）患者30例（轻度CHB6例、中度CHB9例、重度CHB15例），HBV相关性慢加急性肝衰竭（Acute-on-chronic liver failureSACLF)25例。免疫组化分析表达穿孔素的外周血淋巴细胞；用SYBR Green I实时荧光定量PCR方法检测患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中PFP mRNA的含量；流式细胞术分别检测NK、NKT、CTL、HBV特异性CTL细胞的频数及其PFP蛋白表达量。实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测血清HBV DNA载量，美国Beckman CX-V型全自动生化检测仪检测血清ALT水平。结果：1.健康对照组、HBV携带、CHB、及SACLF外周血NK细胞的比例分别是21.47%±13.2%、20.19%±8.08%、11.87%±6.15%及5.18%±3.69%，SACLF患者和CHB患者较健康对照组、乙肝病毒携带明显降低，差异有统计学意义；外周血NKT的比例分别是18.16%±9.33%、20.79%±3.5%、14.28%±6.74%及8.48%±4.14%，SACLF患者和CHB患者较健康对照组、乙肝病毒携带明显降低，差异有统计学意义；非特异性CTL细胞的比例分别是18.5%±1.85%、17.72%±5.89%、23.96%±5.39%及28.83%±5.02%，SACLF患者和CHB患者较健康对照组、乙肝病毒携带明显升高，差异有统计学意义； HBV特异性CTL的比例分别：0.056%±0.038%、0.065%±0.053%、0.75%±0.36%及0.45%±0.14%，CHB比携带者及对照组明显升高差异有统计学意义，SACLF与CHB无差异。2.CHB患者NK、NKT、CTL、HBV特异性CTL细胞的频数与血清ALT的关系：HBV特异性CTL细胞的频数与ALT相关系数r=0.322，P<0.05；NK、NKT、CTL与血清ALT成正相关相关系数分别为： r1=0.656(P1<0.01)， r2=0.57(P2<0.01)，r3=0.637(P3<0.01)。3.慢性HBV感染患者NK、NKT、CTL、HBV特异性CTL细胞的频数与病毒载量的关系：根据HBV DNA水平分为两组，高病毒载量组28例：HBV DNA定量≥10E4IU/ml，低病毒载量组42例，HBV DNA定量<10E4IU/ML。NK%分别为8.85%±2.95%和21.33%±9.73%(P=0.046)； NKT%分别为11.35%±6.52%和22.38%±7.67%(P=0.042)；CTL%分别为16.69±0.32和28.15±0.35(p=0.043)；HBV特异性CTL%分别为0.85%±0.23%和1.21%±0.185%(P=0.038)。4.免疫组化显示：表达棕黄色颗粒穿孔素细胞，SACLF患者明显高于对照组。5.外周血PBMC PFP mRNA基因表达水平：慢加急性SACLF组PBMCs中PFPmRNA表达(0.54±0.78)与CHB患者（0.17±0.20）p=0.035；CHB患者(0.17±0.20)与乙肝病毒携带者（0.061±0.05）p=0.041；乙肝携带者（0.061±0.05）与健康对照组（0.028±0.018）p=0.031；SACLF患者死亡组（1.13±1.12)与存活组（0.14±0.19）p=0.037；低病毒载量组穿孔素基因表达量（1.13±0.83）与高病毒载量(0.09±0.82)p=0.046,差异有统计学意义。6.穿孔素抗体流式标记NK、NKT、CTL、HBV特异性CTL：表达穿孔素非特异性CTL量在SACLF患者为55.01%±10.56%明显高于CHB患者25.04%±5.67%，差异有统计学意义。表达穿孔素特异性CTL在慢乙肝患者为18.96%±6.98%明显高于携带者4.2%±2.6%，表达穿孔素NK及NKT在SACLF分别为84.89%±12.4%及57.47%±1.55%明显高于健康对照组18.54%±16.25%及8.1%±4.53%。结论：1.与健康对照组、乙肝病毒携带相比，CHB、SACLF患者外周血NK、NKT细胞总频数显著降低，但其功能穿孔素表达量明显增加，提示在HBV肝脏炎症时NK、NKT表现为高活性，其活性与肝损害相关。2. HBV特异性CTL和非特异性CTL的细胞频数及穿孔素表达在慢性乙型肝炎患者中明显增高，与血清ALT正相关、与HBV DNA负相关、与SACLF预后相关，提示细胞毒T细胞的数量及穿孔素功能表达与病毒清除和肝损害相关，可作为SACLF患者预后生存有效指标。