背景:仅次于恶性肿瘤和心脑血管疾病,不孕不育是危害人类健康的第三大疾病,其中一半的原因是由男性所致。畸形精子症是导致男性不育的重要原因之一,无头精子症是一种罕见而严重的畸形精子症。无头精子症患者除不育以外无其他临床症状,精液中主要是无头的精子尾,伴有少量无尾的精子头和少量头尾连接异常的精子。因为无头精子症发生在近亲婚配家系或存在家族聚集现象,提示无头精子症与遗传相关。目前在人类中鉴定的无头精子症致病基因有SUN5,PMFBP1,BRDT,HOOK1,TSGA10,DNAH6,CEP112和SPATC1L,但仍有部分患者病因不明,因此鉴定新的致病基因或新的突变位点对无头精子症的诊断与治疗具有重要意义,也有利于阐明精子颈部的结构。方法:研究对象来自安徽医科大学第一附属医院妇产科生殖中心门诊就诊的5名无头精子症患者和1名患者精液中存在无头精子。这6名患者仅有不育的症状,其余各项临床检查结果均在正常范围内。首先提取5名患者的外周血DNA,对无头精子症的致病基因SUN5和PMFBP1的外显子进行PCR扩增和Sanger测序。对未发现这两个基因突变的患者进行全外显子测序,通过SIFT,Polyphen-2和Mutation Taster预测工具筛选致病基因,并且在gnom AD和Ex AC等数据库检测该突变发生频率。再对患者家系验证遗传共分离,对不符合孟德尔遗传定律的患者家系进行q PCR检测基因片段缺失或重复,全基因组测序明确断裂位点。其次通过蛋白印迹和免疫荧光实验检测患者精子中突变蛋白表达和定位改变,构建点突变体和minigene质粒并转入HEK293T细胞,分别分析对表达水平和转录水平的影响。透射电镜用于检测精子鞭毛的超微结构变化。通过CRISPR-Cas9技术构建Cep250基因敲除小鼠模型,进一步研究CEP250在精子发生过程中的作用。结果:（1）在三个家系中鉴定三个SUN5突变,其中1个新的纯合错义突变（c.775G＞A;p.G259S）、1个已知的剪切突变位点（c.340G＞A;p.G114R）和1个复合杂合突变,其中包括了1个大片段缺失（117-kbp）和已知的错义突变位点（c.1043A＞T;p.N348I）;通过q PCR实验推测在SUN5中存在片段缺失隐性遗传于其父亲,并且WGS明确了断裂位点（GRCH37/hg19＿chr20:31486169-31604149）;蛋白印迹和免疫荧光实验证明患者精子中突变的SUN5的表达量明显下降。体外实验证明突变的SUN5在HEK293T细胞中明显降解,并且泛素化蛋白酶体抑制剂（MG132）可抑制了突变SUN5的降解。家系1中患者经过ICSI治疗后获得良好辅助生殖治疗结局。（2）通过WES在家系4（非近亲婚配家系）中鉴定了TSGA10的一个新的剪切突变（NM＿025244:c.1108-1G＞T）,q PCR实验推测患者中存在TSGA10的片段缺失,并且WGS明确了断裂位点（GRCH37/hg19＿chr2:99573953-100558346）。蛋白印迹和免疫荧光实验证明患者精子中TSGA10的表达量明显下降。构建minigene转染HEK293T细胞中,验证TSGA10剪切突变导致转录水平发生异常。（3）通过WES在家系5（近亲婚配家系）中鉴定了AK7的一个新的纯合错义突变（NM＿152327:c.1846G＞A;p.E616K）,蛋白印迹和免疫荧光实验证明患者精子中AK7的表达量明显下降,并且透射电镜显示患者的精子鞭毛的外周二联管存在部分缺失,患者经过两次ICSI治疗后没有获得良好的辅助生殖治疗结局。（4）通过WES在家系6（近亲婚配家系）中鉴定CEP250的一个新的纯合移码突变（NM＿007186:c.4710＿4723del:p.E1570fs*39）,免疫荧光实验证明CEP250定位在正常人精子的颈部。通过CRISPR-Cas9技术制备Cep250-/-小鼠,发现Cep250-/-仅影响雄鼠生育且睾丸体积明显减小,重量约为野生型的25%,HE染色可见生精小管内生精细胞数目明显减少,未见圆形精子和成熟精子。蛋白印迹实验证明SYCP3和γH2A.X蛋白在Cep250-/-雄鼠睾丸内表达明显下降,推测Cep250-/-雄鼠表现为精原细胞阻滞。结论:（1）拓展了无头精子症致病基因SUN5和TSGA10的基因突变谱,推荐WGS作为检测SUN5和TSGA10中的杂合性缺失;（2）拓展了AK7的突变谱和表型谱,为患者精确诊断和辅助生殖治疗策略提供参考价值;（3）新鉴定的无头精子症致病基因CEP250,初步探索CEP250在人类和小鼠中的精子发生过程中的作用。