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目的: 本研究将重组表达质粒pLNCX/anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)先转染T细胞株Jurkat，然后转染外周血T细胞，筛选并检测蛋白表达。进一步检测转染阳性外周血T细胞的活化程度，特异性结合、杀伤erbB2阳性肿瘤细胞的能力。即构建含融合基因anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)的外周血T细胞，为erbB2过表达肿瘤的靶向基因治疗奠定实验基础。 方法: 1.重组表达质粒转染人T细胞株Jurkat、筛选、鉴定、蛋白表达检测 应用脂质体法和电转染技术将重组表达质粒PLNCX/anti-erbB2scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)转染至Jurkat细胞株，先用流式细胞术检测融合基因瞬时表达情况，然后用含1000μg/mLG418的RPMI1640培养液筛选转染阳性Jurkat细胞株，筛选后， PCR鉴定融合基因，应用流式细胞术、RT-PCR、Western blot检测融合基因的稳定表达情况。 2.重组表达质粒转染人外周血T细胞、筛选、鉴定、蛋白表达检测 从人外周血中分离培养T淋巴细胞，采用电转染技术将重组表达质粒PLNCX/anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)转染至外周T，用含600μg/mL G418的RPMI1640培养液筛选转染阳性T细胞，先用RT-PCR技术检测融合基因表达情况，然后用westernblot验证蛋白表达情况。 3.转染的外周血T细胞结合erbB2阳性肿瘤细胞SK-BR-3能力的检测 实验组在6孔板中每孔加入1ml2×106转染的外周血T细胞和1ml1×105erbB2阳性肿瘤细胞SK-BR-3，体外共同培养48小时后，在显微镜下观察转染的外周血T细胞结合SK-BR-3的情况，SK-BR-3细胞数量和形态的变化。以未转染的外周血T细胞和SK-BR-3共同培养为阴性对照组。 4.ELISA夹心法检测转染的外周T与靶细胞共同培养后上清中IL-2和IFN-γ的含量 把转染的外周血T细胞与erbB2阳性肿瘤细胞株SK-BR-3在体外共同培养3天，ELISA法检测共同培养上清液中转染T细胞激活情况包括IL-2、IFN-γ等细胞因子水平。以未转染的外周T和erbB2阴性乳腺癌细胞MCF-7为两组阴性对照。 5.LDH释放法检测转染的外周T对erbB2阳性肿瘤细胞SK-BR-3的杀伤能力 96孔板每孔加100μl，1×104个/每种细胞:包括单独培养的转染的外周T（效应细胞自然释放孔）、单独培养的SK-BR-3（靶细胞自然释放孔）、待裂解的单独培养的SK-BR-3（靶细胞最大释放孔）、转染的外周T与SK-BR-3共培养（实验孔）以及无细胞的培养液（空白孔）。共培养48h。以未转染的外周T和erbB2阴性乳腺癌细胞MCF-7为两组阴性对照。LDH法检测O.D.值。并比较外周血T细胞膜表面锚定的anti-erbB-2 scFv与可溶性Herceptin（MTT法检测）抑制杀伤靶细胞能力的差异。 结果: 1.转染T细胞株及融合基因表达情况 重组表达质粒PLNCX/anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)瞬时转染人淋巴瘤T细胞株Jurkat，在转染36h后能够检测到融合蛋白的表达。转染后用G418筛选15d，经PCR鉴定存在融合基因，经RT-PCR、Western blot检测能够转录和翻译，经流式细胞术检测，融合蛋白表达量达42.76％。 2.转染外周血T淋巴细胞及融合基因表达情况 电转染外周T经G418筛选后获得大量稳定转染的原代T淋巴细胞，RT-PCR和Westernblot检测均有蛋白表达。 3.转染的外周血T细胞结合erbB2阳性肿瘤细胞的能力 转染的外周T与erbB2阳性肿瘤细胞株SK-BR-3在体外共同培养48h，显微镜下观察SK-BR-3细胞株变圆、拉丝、碎片增加，数量减少，且T细胞围在SK-BR-3细胞的周围，形成花环状。 4.转染的外周血T细胞的激活情况 转染的外周T与erbB2阳性肿瘤细胞株SK-BR-3在体外共同培养3天，ELISA夹心法检测培养上清液中IL-2和IFN-γ水平与对照组相比明显升高(P＜0.05)。 5.转染的外周血T细胞对erbB2阳性肿瘤细胞的杀伤能力 LDH释放法检测转染T细胞对SK-BR-3细胞的杀伤效率为58％左右。转染的外周T对SK-BR-3的杀伤率％较对照组显著增加(P＜0.05)。 结论: 融合基因anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-ζ能表达于T细胞株和外周血T细胞。转染阳性的外周血T细胞能够被激活，在体外有效地特异性结合和杀伤erbB2阳性肿瘤细胞。为以erbB-2受体为靶向的活化T细胞的抗肿瘤基因治疗奠定了实验基础。