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目的:地塞米松已成为临床早产防治的常规用药之一。流行病学调查研究发现,地塞米松治疗所致的新生儿低出生体重与成年后多种慢性疾病的发生关系密切。动物研究也表明,孕期地塞米松暴露（prenatal dexamethasone exposure,PDE）可导致雌性子代生殖功能异常,卵巢储备减少。本室前期研究表明,PDE可引起胎鼠卵泡发育异常并可延续到F3代。本研究拟在整体动物水平观察PDE所致子代卵巢雌激素合成功能抑制的跨代遗传效应,并在体外大鼠胎卵巢培养及人体细胞水平探究其宫内编程改变的分子机制。方法:受孕Wistar大鼠于孕9天（gestational day,GD9）至GD20给予地塞米松（0.2mg/kg·d）皮下注射。一部分孕鼠于GD20时经异氟烷麻醉,随机处死部分孕鼠并剖宫取雌性胎鼠,另一部分孕鼠自然分娩生产F1代,8周龄（postnatal week 8,PW8）的PDE F1代雌鼠与正常雄鼠合笼,自然生产F2代,以相同方式获取F3代。分别于F1代、F2代、F3代出生后PW 8处死并取血和卵巢组织,同时对部分F1、F2代雌鼠于PW 12进行超排卵处理以获得卵母细胞进行相关检测。放射免疫法检测血清雌二醇（estradiol,E2）水平,苏木精-伊红染色观察观察卵巢形态学;在卵巢组织中检测糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor,GR）、Runt相关转录因子2（RUNX family transcription factor 2,RUNX2）和细胞色素P450芳香化酶（cytochrome P450 aromatase,P450arom）的基因/蛋白水平,检测卵巢组织及卵母细胞的mi RNA320a-3p的表达。在体外培养的大鼠胎卵巢组织及人卵巢颗粒细胞系（human granulosa-like tumor cell line,KGN）上,我们用500 n M地塞米松给药72 h后进行相关检测,并进一步对调控通路中的关键分子GR/mi RNA320a-3p/RUNX2进行干预,检测与动物实验相对应的指标。结果:动物实验:（1）与对照组相比,PDE可致F1代雌性成年子代大鼠血E2水平降低,P450arom m RNA表达抑制（P＜0.01）;免疫组化染色显示,P450arom主要在卵巢颗粒细胞表达,呈现黄色颗粒,PDE组F1代子代卵巢P450arom阳性细胞明显减少,定量分析结果发现,P450arom蛋白表达显著降低（P＜0.01）;同时伴随卵巢次级卵泡数量减少,窦卵泡增加（P＜0.05,P＜0.01）。进一步发现,PDE组F2代雌性子代仍然表现为血E2水平、P450arom m RNA及蛋白表达显著降低,以及卵巢窦卵泡减少和闭锁卵泡增多（P＜0.05,P＜0.01）。且PDE组F3代子代持续存在血E2水平、P450arom m RNA及蛋白表达的显著降低,以及卵巢原始卵泡减少,闭锁卵泡增多（P＜0.05）。（2）与对照组相比,PDE可致F1代雌性子代卵巢mi RNA320a-3p表达抑制（P＜0.05）、RUNX2 m RNA表达上调（P＜0.05）;免疫组化染色显示,RUNX2主要在卵巢颗粒细胞表达,呈现黄色颗粒,PDE组F1代子代卵巢RUNX2阳性细胞明显增多,同时免疫组化定量分析结果发现,PDE组卵巢RUNX2的蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）;进一步的染色质免疫沉淀结果显示,PDE组F1代子代卵巢中RUNX2与P450arom启动子区结合增多（P＜0.01）。进一步发现,PDE组F2代雌性子代仍然表现为mi RNA320a-3p的表达抑制、RUNX2m RNA及蛋白表达显著升高,以及RUNX2与P450arom启动子区结合增多（P＜0.05,P＜0.01）。且PDE组F3代子代持续存在mi RNA320a-3p表达抑制、RUNX2 m RNA及蛋白表达显著升高,以及RUNX2与P450arom启动子区结合增多（P＜0.05,P＜0.01）。（3）与对照组相比,PDE胎鼠卵巢中卵母细胞数量未出现明显改变,但卵巢最大横截面积减小（P＜0.05）,且PDE组胎鼠卵巢P450arom m RNA表达抑制（P＜0.01）,免疫组化及定量分析结果也显示,P450arom蛋白表达降低（P＜0.05）,同时血E2水平显著降低（P＜0.05）。我们进一步检测了胎鼠卵巢中GR、mi RNA320a-3p及RUNX2的表达。与对照组相比,PDE组胎鼠卵巢GR m RNA表达显著升高（P＜0.05）,mi RNA320a-3p表达下调（P＜0.05）,同时RUNX2 m RNA表达增加（P＜0.01）,免疫组化及定量分析结果也显示RUNX2蛋白表达的升高（P＜0.05）,同时伴随RUNX2与P450arom启动子区结合增多（P＜0.05）。体外胎鼠卵巢培养实验:与对照组相比,给予500 n M的地塞米松培养72 h后,胎卵巢组织GR m RNA表达显著增加,mi RNA320a-3p表达抑制但RUNX2 m RNA表达升高,同时P450arom m RNA显著下调（P＜0.05,P＜0.01）。给予mi RNA320a-3p mimics后,胎卵巢组织中的mi RNA320a-3p表达明显升高,并可逆转地塞米松所致的胎卵巢RUNX2m RNA表达升高和P450arom m RNA表达抑制（P＜0.05,P＜0.01）;免疫组化及定量分析也显示mi RNA320a-3p mimics可逆转地塞米松对胎卵巢RUNX2和P450arom蛋白表达的影响（P＜0.05,P＜0.01）。进一步的GR干扰实验结果显示,与对照组相比,给予GR拮抗剂RU486干预后,胎卵巢组织中mi RNA320a-3p表达上调,并可逆转地塞米松所致的胎卵巢RUNX2 m RNA表达升高和P450arom m RNA表达抑制（P＜0.05,P＜0.01）;免疫组化及定量分析也显示RU486可逆转地塞米松对胎卵巢RUNX2和P450arom蛋白表达的影响（P＜0.05,P＜0.01）。体外人卵巢颗粒细胞系培养实验:与对照组相比,500 n M地塞米松处理72 h可引起卵巢颗粒细胞GR核转位增加（P＜0.05）,mi RNA320a-3p表达下调（P＜0.01）,以及RUNX2的表达升高和P450arom表达抑制（P＜0.05）。对KGN人卵巢颗粒细胞系进行mi RNA320a-3p质粒转染诱导mi RNA320a-3p过表达,mi RNA320a-3p的表达显著升高（P＜0.05）,且可逆转地塞米松所致的KGN人卵巢颗粒细胞RUNX2 m RNA表达升高和P450arom m RNA表达抑制（P＜0.05）;免疫组化及定量分析也显示mi RNA320a-3p mimics可逆转地塞米松对胎卵巢RUNX2和P450arom蛋白表达的影响（P＜0.05,P＜0.01）。我们进行了双荧光素酶报告基因检测,确证mi RNA320a-3p对RUNX2的靶向直接作用（P＜0.05,P＜0.01）。给予GR拮抗剂RU486干预后,KGN细胞系中mi RNA320a-3p的表达上调,并可逆转地塞米松所致的KGN细胞系中RUNX2 m RNA表达升高和P450arom m RNA表达抑制（P＜0.05,P＜0.01）;免疫组化及定量分析也显示RU486可逆转地塞米松对胎卵巢RUNX2和P450arom蛋白表达的影响（P＜0.05,P＜0.01）。与对照组相比,地塞米松通过升高RUNX2引起RUNX2与P450arom的结合增多（P＜0.01）。在给予RUNX2 si RNA后,P450arom的表达上升（P＜0.05,P＜0.01）。卵母细胞实验:与对照组相比,PDE组F1代卵母细胞mi RNA320a-3p表达抑制（P＜0.05,P＜0.01）,进一步发现,PDE组F2代卵母细胞仍然表现为mi RNA320a-3p表达抑制（P＜0.05,P＜0.01）。进一步,我们检测了胎鼠卵巢mi RNA320a-3p启动子区Cp G位点的甲基化状态。结果显示,与对照组相比,PDE组胎鼠卵巢mi RNA320a-3p启动子区部分Cp G位点甲基化修饰改变,但均没有统计学意义。结论:PDE可激活胎鼠卵巢GR,通过抑制mi RNA320a-3p的表达靶向上调RUNX2,进一步通过下调P450arom的表达引起雌激素合成功能抑制。PDE所致的卵巢mi RNA320a-3p表达抑制可通过F1代的生殖细胞影响F2代,由于其遗传稳定性,致间接暴露于地塞米松的F2代生殖细胞也出现mi RNA320a-3p表达抑制并遗传至F3代,经过mi RNA320a-3p/RUNX2/P450arom的级联效应,最终PDE子代卵巢雌激素合成功能抑制的多代遗传效应。