【摘 要】
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研究目的:明确天然颅骨发育及其矿化过程中镁元素发挥的作用,并从微观角度探究过量镁对骨骼矿化产生的影响。材料和方法:将C57BL/6小鼠合笼,每隔1天收集处于发育不同时间点的小鼠胚胎,体视显微镜分离颅骨,行冷冻干燥后采用ICP-OES定量测定颅骨所含的钙元素、镁元素等;在颅骨矿化前沿取材,戊二醛固定后,采用透射电镜观察分析生物体内细胞内外的矿化过程,采用扫描透射电镜模式进行样品局部元素含量的半定量测
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研究目的:明确天然颅骨发育及其矿化过程中镁元素发挥的作用,并从微观角度探究过量镁对骨骼矿化产生的影响。材料和方法:将C57BL/6小鼠合笼,每隔1天收集处于发育不同时间点的小鼠胚胎,体视显微镜分离颅骨,行冷冻干燥后采用ICP-OES定量测定颅骨所含的钙元素、镁元素等;在颅骨矿化前沿取材,戊二醛固定后,采用透射电镜观察分析生物体内细胞内外的矿化过程,采用扫描透射电镜模式进行样品局部元素含量的半定量测定;提取C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞,体外诱导分化为成骨细胞,添加各浓度梯度的氯化镁,行茜素红染色检测矿化效果;提取各矿化阶段时间点的RNA,行RT-q PCR检测各成骨标记物的转录水平;额外添加1m M镁离子后,在细胞矿化各阶段采用透射电镜、扫描电镜等观察分析体外矿化过程中细胞的形貌变化;用高镁饮食喂养未成年雌鼠,成年后与正常雄鼠合笼,收集特定时间点的胚胎期颅骨,进行透射电镜观察分析;高镁饮食饲养下的胚鼠出生,哺乳期后继续给予高镁饮食,直至成年,取颅骨、股骨、胫骨、子宫、卵巢等器官,冷冻干燥后采用ICP-OES定量测定钙、镁元素含量;采用点式EDS进行微观元素分析;采用SAED分析检测矿化前体及胶原的结晶状态。结果:C57BL/6小鼠颅骨于E13.5天开始富集无机元素,E15.5天时镁元素开始下降,钙元素保持继续上升趋势;各时期线粒体内元素半定量测定有相同趋势;EDS和SAED检测显示镁离子在矿化好的胶原处含量低,在矿化差的胶原处含量高,在胞内矿化前体处含量高,在胞外矿化前体处含量低;在骨髓间充质干细胞的矿化诱导液中额外添加0.25m M镁离子对矿化略有促进,之后随着浓度增加,均显示出抑制矿化效果;矿化开始后分别在不同时期开始换成含1m M矿化液,发现加入越早对矿化的抑制效果越强;矿化前期各成骨标志物的m RNA水平表明,高浓度镁离子对Alp和Col1有抑制作用,而对成骨分化指标（Runx2和Osterix）影响较小;扫描电镜显示,加入1m M镁离子矿化于矿化液后,细胞外基质胶原含量减少,羟基磷灰石形貌改变;透射电镜显示,细胞外基质胶原不成熟且矿化减弱;体外模拟胶原矿化实验同样表明在镁的处理下胶原矿化变差;透射电镜观察高镁饮食喂养后所得颅骨样本,胶原矿化变差;ICP-OES结果同样显示高镁喂养后颅骨、长骨镁含量上升的同时,钙含量下降;生物力学测定表明高镁喂养后的小鼠骨骼会变脆。结论:调节镁离子的正常浓度对正常的生物矿化至关重要。随着发育过程的进展,骨组织富集足够的镁元素,镁的存在可以保护无定型磷酸钙不会提前结晶,保证胶原上正常聚集矿化前体进而完成矿化。在发育后期,镁元素开始下降,以防形成错误形态的羟基磷灰石。如果在发育前期存在高浓度的镁离子,则会抑制胶原蛋白和碱性磷酸酶的产生,影响骨骼形成所需原材料的储备,从而影响骨骼矿化程度。在矿化后期如果镁离子浓度不降低,持续高浓度的镁离子则会改变羟基磷灰石结晶形态并阻碍胶原纤维的成熟结晶。另外,雌鼠给予高镁饮食后,亦会影响小鼠后代骨骼的正常发育。
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