健康的瘤胃是反刍动物饲养的核心,贯穿于反刍动物的各个生长、生产周期之中。固体型精料开食料的补饲在促进幼龄反刍动物瘤胃乳头增殖的同时,也可能造成瘤胃食糜粘附、酸中毒等,影响瘤胃健康。研究表明,粗饲料的补饲不仅能够提高反刍动物的生产性能,还能降低瘤胃食糜粘附,促进瘤胃健康,但粗饲料促进瘤胃发育的机制尚不清楚。本论文以幼龄湖羊为对象,研究了早期补饲苜蓿对断奶前后生产性能和瘤胃发育的影响,并从瘤胃微生物、代谢物、瘤胃基因表达三个方面,初步探索了补饲苜蓿促进羔羊生长和瘤胃发育的机制。研究从宏观到微观、从基因到代谢,为促进瘤胃早期健康发育提供了重要支撑。1早期补饲苜蓿对幼龄湖羊生长和瘤胃发育的影响试验选取66头5日龄湖羊,经5天适应期后,开始正式试验,试验期共8周。试验开始时（10日龄,第0周）,随机屠宰6只作为未采食固体饲料的基线组（CON）,其余60只随机分为两组:精料组（STA）饲喂代乳粉和颗粒状精料开食料;苜蓿组（S-ALF）在精料组日粮的基础上加饲苜蓿。所有试验羊在第4周末（38日龄）断奶。断奶后,所有湖羊饲喂相同的苜蓿和粉状精料（限饲300g/天）。每周连续两天测定采食量、体重（BW）;第8周使用全收粪法测定消化率。于试验期第1、2、4、5、8周末,每组随机选取6头湖羊进行屠宰;宰前颈静脉采血,宰后立即测定胴体、前胃和脏器重,采集瘤胃组织及内容物,用于后续分析。结果显示,与STA组相比,断奶前S-ALF组精料开食料采食量在第4周有上升的趋势（P<0.10）,总干物质（DM）、粗蛋白（CP）和中性洗涤纤维（NDF）采食量、BW和日增重（ADG）在第3、4周均显著高于STA组（P<0.05）;断奶后,S-ALF 组精料采食量（P<0.05）、BW（P<0.01）、ADG（P<0.10）、胴体重（P<0.05）显著高于STA组,前胃重（P<0.10）和脏器重（P<0.10）有高于STA组的趋势。断奶后一周,S-ALF组羔羊血液尿素氮浓度高于STA组（P<0.05）,而丙酸的比例显著降于STA组（P<0.05）,pH值未发生显著变化。瘤胃上皮营养素转运载体mRNA表达量结果显示,断奶前,S-ALF组MCT4的相对表达量在数值上高于STA组;NHE1、NHE2和NHE3的表达量在S-ALF组断奶前后均无显著变化,但STA组NHE2和NHE3分别在第2和4周增加达到显著水平（P<0.05）,NHE1随日龄增加而增加,在第8周显著高于第0周（P<0.05）。S-ALF血液中β-羟丁酸的含量在断奶后显著高于STA组（P<0.01）,瘤胃上皮粘附斑块的发生率低于STA组,瘤胃肌肉层厚度在第4周显著高于STA组（P<0.05）,瘤胃角质层厚度、乳头长度和宽度两组无显著差异。瘤胃上皮紧密连接蛋白和炎症因子mRNA表达量结果显示,S-ALF组claudin-1、claudin-4、occludin、IL-1β、IL-6、IL-10和TGF-β1的表达量在断奶前后均无显著变化,而 STA组claudi-的表达量在第 2 周显著增加（P<0.05）,claudin-4、occludin、1β、IL-6、IL-10和TGF-β1的表达量在断奶后一周显著增加（P<0.05）。上述结果表明,早期补饲苜蓿能够促进羔羊采食,增加营养物质的摄入量,并促进营养物质的吸收,促进瘤胃发育,维持瘤胃上皮屏障的稳定,减少断奶时的炎症反应,从而促进羔羊的生产性能,并使羔羊在断奶后能尽快适应饲粮的转换,减缓断奶应激。2早期补饲苜蓿对幼龄湖羊瘤胃微生物演替的影响相似性分析（ANOSIM）显示,与STA组相比,断奶前S-ALF瘤胃内容物中微生物和瘤胃上皮微生物区系与断奶后微生物区系更加相似。瘤胃内容物中微生物多样性结果显示,断奶前,和第0周相比,STA组Actinobacteria的相对丰度从2.1%升高至17.4%,而Firmicutes的相对丰度从52.0%降低至39.0%;断奶后,和第4周相比,Bacteroidetes的相对丰度从41.0%增加至51.0%,Proteobacteria的相对丰度从2.2%增加至5.0%,而Actinobacteria的相对丰度从17.4%降低至2.2%。S-ALF组瘤胃内容物中微生物相对丰度的变化与精料组趋势基本一致。属水平分析显示,S-ALF组Butyrivibrio的相对丰度在断奶前逐渐升高,而STA组Butyrivibrio的含量在断奶后才开始升高;断奶后,S-ALF组 unclassified Clostridiales 和 unclassifiedMogibacteriaceae 的相对丰度显著高于 STA 组（P<0.05）;和断奶前相比,断奶后STA组有15个属变化显著,而S-ALF组中只有6个属变化显著。瘤胃上皮微生物多样性结果显示,断奶前,和第0周相比,STA组Actinobacteria的相对丰度从2.5%升高至19.1%（P<0.05）;断奶后,和第4周相比,STA组上皮Firmicutes 27.0%升高至 46.3%（P<0.05）,Proteobacteria的相对丰度从 19.6%升高至28.6%（P<0.05）,Bacteroidetes 的相对丰度从32.6%降低至 21.0%（P<0.05）,Actinobacteria的相对丰度从19.1%降低至1.98%（P<0.05）。S-ALF组瘤胃上皮微生物含量的变化与精料组趋势基本一致。属水平分析显示,断奶前S-ALF组unclassifiedClostridiales、Mogibacterium、unclassified Ruminococcaceae、Atopobium、Succiniclasticum 和 Butyrivibrio的相对丰度显著高于STA组（P<0.05）;和断奶前相比,断奶后STA组上皮微生物有18个属变化显著,而S-ALF组上皮粘附微生物只有7个属变化显著。上述结果表明,补饲苜蓿能诱导瘤胃微生物区系在断奶前就部分接近断奶后,减少断奶前后细菌属水平的变化,提高微生物区系的稳定性,从而促进羔羊对断奶后高纤维日粮的适应性,减少断奶应激。3早期补饲苜蓿对瘤胃微生物代谢产物的影响代谢组学结果显示,和断奶前（第4周）相比,断奶后一周的STA组羔羊瘤胃中有21个代谢物的相对浓度显著增加,25个代谢物的相对浓度显著降低（VIP≥1.0且|Log2（FC）|≥1.0）,富集的关键代谢通路为精氨酸和脯氨酸代谢（P=0.035）、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸代谢（P=0.038）以及D-谷氨酰胺和D-谷氨酸盐的代谢（影响因子=1.0）;断奶后一周的S-ALF组羔羊瘤胃中有18个代谢物的相对浓度显著增加,19个代谢物的相对浓度显著降低（VIP≥1.0且|Log2（FC）|≥1.0）,富集的关键代谢通路为淀粉和蔗糖代谢（P=0.012）以及D-谷氨酰胺和D-谷氨酸盐（影响因子=1.0）。断奶前,和STA组相比,S-ALF组中有21个代谢物的相对浓度显著增加,5个代谢物相对浓度显著降低（VIP>1.0且|Log2（FC）|≥1.0）,富集的关键代谢通路为丁酸甲酯代谢（P=0.048）;断奶后,和STA组相比,S-ALF组中有18个代谢物相对浓度显著增加,8个代谢物的相对浓度显著降低（VIP≥1.0且|Log2（FC）|≥1.0）,富集的关键代谢通路为淀粉和蔗糖代谢（P=0.006）。相关分析结果显示,尿酸和泛酸与瘤胃内容物中Butyrivibrio呈正相关（P<0.05且R>0.50）;胍基乙酸、植烷酸、塔格糖、苯甲酸和葡萄糖醛酸与瘤胃内容物中unclassified Mogibacteriaceae呈正相关（P<0.05且 R>0.50）;香芹酮与瘤胃上皮Bifidobacterium呈正相关（P<0.05且R>0.50）,水杨酸、半胱氨酰甘氨酸与Bifdobacterium呈负相关（P<0.05且R<-0.50）;水杨酸、半胱氨酰甘氨酸与瘤胃上皮Mogibacterium呈正相关（P<0.05且R>0.50）;乳糖、半胱氨酰甘氨酸与瘤胃上皮Succiniclasticum呈正相关（P<0.05且R>0.50）,香芹酮与Succiniclasticum呈负相关（P<0.05且R<-0.50）。上述结果表明,补饲苜蓿改变瘤胃中代谢产物的组成,其中与瘤胃内容物中微生物相关的代谢物与供给能量、调控瘤胃菌群、维持瘤胃厌氧环境和肝脏的解毒作用有关,与瘤胃上皮微生物相关的代谢物与促进瘤胃上皮发育、维持瘤胃上皮健康和氨基酸代谢有关。4早期补饲苜蓿对湖羊瘤胃壁基因表达的影响瘤胃转录组测序结果显示,和第0周相比,断奶前STA组有580个基因显著上调,833个基因显著下调（FDR≤0.05且|Log2（FC）|≥1）;S-ALF组断奶前有637个基因显著上调,939个基因显著下调（FDR≤0.05且|Log2（FC）|≥1）。和断奶前相比,断奶后一周STA组有66个基因显著上调,93个基因显著下调(FDR≤0.05且|Log2（FC|≥1）;S-ALF组有27个基因显著上调,31个基因显著下调（FDR≤0.05且|Log2（FC）|≥1）,且变化的基因与STA组不同。断奶前,S-ALF组中CYP1A1、MYOM1、PDK4表达量显著高于STA组,ZNFX1-AS1₂表达量显著低于STA组;断奶后,S-ALF组中ADIPOQ、C7表达量显著高于STA组,FABP4、GPNMB表达量显著低于STA组（FDR≤0.05且|Log2（FC）||≥1）。随机选取10个基因,采用荧光定量PCR进行验证,结果显示,荧光定量PCR与转录组测序结果趋势一致,说明转录组测序结果一致。上述结果表明,渐进性补饲苜蓿在断奶前诱导部分基因的变化,使断奶前瘤胃壁的基因表达状态更接近断奶后,减少断奶带来的瘤胃壁基因表达的变化,缓解断奶应激。4早期补饲苜着促进生长和瘤胃发育的机制多元分析羔羊生长、瘤胃发育指标、瘤胃微生物丰度和瘤胃组织基因表达的结果显示,渐进性的采食苜蓿在断奶前增加瘤胃内容物中Butyrivibrio的相对丰度,提高瘤胃消化NDF的能力;增加瘤胃上皮Butyrivibrio和Succiniclasticum的相对丰度,促进瘤胃上皮对丁酸和丙酸的利用,同时增加瘤胃上皮unclassified Clostridiales、unclassified Ruminococcaceae和Atopobium的相对丰度,促进瘤胃上皮的健康;在断奶后,增加羔羊瘤胃内容物中 unclassified Clostridiales、unclassifiedMogibacteriaceae 的相对丰度,提高瘤胃的纤维消化能力,促进对高纤维日粮的适应性,缓解断奶应激,从而促进断奶前后瘤胃的发育,并进一步提高羔羊的生产性能。早期补饲苜蓿的湖羊瘤胃中香芹酮的相对浓度降低,ZNFX1-AS1₂表达量降低,MYOM1的表达量增加,它们分别在瘤胃微生物代谢、瘤胃细胞增殖和瘤胃肌肉发育中起着不同作用,可能作为苜蓿诱导瘤胃发育在断奶前的生物标志物;断奶后,补饲苜蓿的羔羊瘤胃中有较高浓度的胍基乙酸,在断奶后维持能量供应具有重要作用,可能作为苜蓿诱导瘤胃发育在断奶后的生物标志物。因此,早期补饲苜蓿在断奶前增加羔羊瘤胃内容物中Butyrivibrio的相对丰度,增加断奶后 unclassified Clostridiales、unclassified Mogibacteriaceae 的相对丰度,提高瘤胃的纤维消化能力;增加瘤胃上皮 Butyrivibrio 和 Succiniclasticum、unclassified Clostridiales、unclassified Ruminococcaceae和Atopobium的相对丰度,促进瘤胃上皮的健康发育;增加断奶后瘤胃中胍基乙酸和麦芽糖等代谢产物的浓度,提高断奶后的能量供应;促进断奶前基因的表达,而在断奶后维持基因表达的稳定,从而减少断奶时的炎症反应,提高能量供应,减缓断奶应激,从而提高生产性能。