植物体内的Micro RNAs（miRNAs）是一类非编码具有调控功能的小RNA分子,对植物的形态构建、生长发育、激素应答、生物和非生物胁迫等方面起着重要的调节作用,然而现阶段miRNA396在植物愈伤组织分化和不定芽生长过程中的作用研究还很少。为初步探讨尾巨桉不同类型愈伤组织分化差异及miRNA396在尾巨桉愈伤形成与分化中的生物学功能,本文以DH32-29尾巨桉无菌苗茎段外植体为实验材料,在不同条件下进行培养,分化出不同形态愈伤组织后测定它们生理生化以及内源激素含量的差异;同时将尾巨桉不同形态的愈伤组织进行转录组测序,比较和分析四种愈伤组织GRFs以及CKXs基因的相对表达量。此外,通过构建miRNA396的CRISPR/Cas9编辑载体,对尾巨桉愈伤组织进行转化研究,以初步确定尾巨桉不同类型愈伤组织分化差异及miRNA396对尾巨桉愈伤组织形成和分化的影响。主要研究内容与结果如下:1.在愈伤诱导培养基上暗培养尾巨桉茎段外植体,两周后分化出黄色愈伤组织,将一部分愈伤组织继续暗培养,一周后愈伤组织分化成白色;一部分愈伤组织换至芽分化培养基暗培养一周,愈伤组织分化成绿色;取出剩下部分黄色愈伤组织光照培养,一周后愈伤组织分化成红色。对不同形态尾巨桉愈伤组织的生理生化性质测定和分析发现,相较于绿色愈伤组织,其他三个颜色愈伤组织的蛋白质含量和CAT活性差异都达到了极显著水平,SOD活性差异都达到了显著水平,POD活性差异在红色愈伤组织中达到了极显著水平而在白色和黄色愈伤组织中差异不显著,PPO活性差异在白色和黄色愈伤组织中达到了极显著水平而在红色愈伤组织中不显著。白色、绿色、黄色愈伤组织酶活性增强,可以更好的消除植物中由于外部环境作用而产生的活性氧,能及时对外界不良环境做出应激反应,而红色愈伤组织对外界的适应能力相对更弱。且不同愈伤组织内源生长素和细胞分裂素富集程度差异较大,而酶系统和激素信号通路之间呈双向链接关系,它们之间相互作用影响了尾巨桉生物量的积累及生理代谢过程。2.对不同形态的尾巨桉愈伤组织进行转录组分析发现,与绿色愈伤组织比较,红色愈伤组织的差异表达基因2203个,其中上调表达基因764个,下调表达基因1,439个;白色愈伤组织差异表达基因2,485个,其中上调表达基因1,493个,下调表达基因992个;黄色愈伤组织差异表达基因2,078个,其中上调表达基因977个,下调表达基因1,101个。差异表达基因热图结果表明,四种愈伤组织具有显著的聚类差异。从差异表达基因中筛选到miRNA396的靶基因GRFs和细胞分裂素脱氢酶相关基因CKXs,对其进行GO和KEGG的富集,推测miRNA396在尾巨桉体内主要通过控制细胞壁的形成和细胞分裂素信号传导及应答影响尾巨桉愈伤组织的形成和分化。3.提取尾巨桉四种不同类型愈伤组织RNA,逆转录为c DNA,对miRNA396靶基因GRFs和细胞分裂素脱氢酶相关基因CKXs进行荧光定量PCR,发现红色尾巨桉愈伤组织相对于绿色愈伤组织除了GRF5表达量是上调之外,其他GRFs表达量均下调,而尾巨桉白色、黄色愈伤组织的GRFs相对于绿色愈伤组织均上调,且黄色愈伤组织的表达量差异最为显著,同时红色愈伤组织除CKXB表达量相较于绿色愈伤组织下调以外,其他CKXs表达量均上调,而白色和黄色愈伤组织所有CKXs表达量均上调,且差异均达到显著或极显著水平。初步确定miRNA396通过调控GRFs影响尾巨桉内源激素的水平来影响愈伤组织的形成和分化,同时可影响CKXs的表达。4.根据尾巨桉miRNA396A和miRNA396B序列设计2个g RNA,以p CBC质粒为模板扩增miRNA-g RNA,扩增后条带大小与预期一致,将酶切成功的p HEE401E-35S-RUBY质粒与miRNA-g RNA重组构成新载体质粒p HEE401E-35S-RUBY-gmiRNA396。转化大肠杆菌感受态细胞,菌液和质粒PCR结果符合预期,碱基测序结果与预期序列相符,表明p HEE401E-35S-RUBY-gmiRNA396载体构建成功。重组载体转化农杆菌感受态细胞,菌液PCR结果符合预期,表明工程菌构建成功。工程菌转化尾巨桉愈伤组织,对转化子进行RUBY基因红色表型筛选与分子鉴定,在红色阳性转化子中,RUBY基因表达量最高,说明尾巨桉愈伤组织转化成功。在现有样品检测中,尾巨桉miRNA396成功编辑情况还未发现,有待进一步加大取样量来进行鉴定。综上,miRNA396在尾巨桉愈伤组织体内主要通过调节激素信号转导、激素应答以及细胞壁木质素生物合成等途径影响尾巨桉愈伤组织的形成和分化。本研究为建立尾巨桉高效再生及遗传转化体系提供了科学依据。