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目的:构建真核表达载体NM23-p IRES2-EGFP,并且分别做酶切与DNA测序鉴定准确性,为下一步探讨NM23基因对胃癌细胞的增殖凋亡与转移提供实验基础。方法:1.用TRIZOL法从人的正常胃粘膜组织中提取总的RNA,通过RT-PCR法扩增NM23基因,获得NM23基因的CDS序列;选择琼脂糖凝胶电泳鉴定,割胶纯化后回收NM23基因。2.与p MD18-T-simple克隆载体连接,得到p MD18-T-simple-NM23,送公司进行测序,测序结果与Genebank报道的人NM23基因序列一致。3.NM23基因与酶切处理后的载体pl RES2-EGFP连接,构建表达载体NM23-p IRES2-EGFP,用PCR、酶切与DNA测序检测重组质粒序列的准确性。结果:1.从人的正常胃粘膜组织中扩增出NM23基因,琼脂糖凝胶电泳显示RT-PC R产物在条带500-750bp之间,与文献的理论值534bp相符。2.与克隆载体p MD18-T-simple连接,测序鉴定与Genebank数据库记录的NM23基因的CDS区序列完全一致。3.使用克隆技术构建真核表达载体NM23-p IRES2-EGFP,并选用PCR、酶切与DNA测序进行验证,结果表明真核表达载体NM23-p IRES2-EGFP构建成功。结论:1.用TRIZOL法从人正常的胃粘膜组织中可扩增出大小为534bp的NM23基因,作为下一步构建载体的目的基因。2.NM23基因连接TA克隆载体,得到重组质粒p MD18-T-simple-NM23。3.成功构建质粒NM23-p IRES2-EGFP,经PCR、Xho I/Ba m HI双酶切、测序等证实了该重组质粒的准确性。