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丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）为唇形科鼠尾草属植物,以其干燥根和根茎入药,具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈等功效。丹参的主要有效成分为苯丙烷类化合物——丹酚酸和二萜醌类化合物——丹参酮。因其药效成分明确,基因组相对较小,组织培养技术成熟,丹参成为诠释中药活性成分生物合成机制的模式药用植物。研究发现,诸多转录因子、结构基因均可调控其丹酚酸类有效成分的生物合成,而丹参酮类化合物由于其合成途径较为复杂,研究相对较少。microRNAs（miRNAs）是一类长度约21nt的内源性非编码小RNA,是调控基因表达水平的一类重要调控因子。成熟的miRNA通常有多个靶基因,可在转录后调控靶基因表达水平。miR396是植物体内保守的miRNA家族,在植物发育与胁迫响应等生理活动中发挥重要功能。此外,研究发现水稻中OsmiR396靶向OsGRF8调控黄酮类化合物的生物合成,而目前药用植物中尚未有miR396调控次生代谢的报道。目前,丹参中miRNAs的研究不多,有关miR396功能研究尚未见报道。本实验室前期克隆了丹参smi-MIR396b基因并将其构建到pCAM1302植物表达载体中,采用农杆菌介导的叶盘法对丹参进行遗传转化,通过潮霉素抗性筛选和PCR分子鉴定,获得了丹参毛状根。本研究在前期研究的基础上,通过qRT-PCR证实了毛状根中miR396b过表达水平,并检测了丹参酮、丹酚酸及花色素的含量及萜类途径和苯丙烷途径基因的表达水平,通过转录组、small RNA、降解组、5’RLM-RACE、qRT-PCR、启动子分析、酵母单杂、胁迫等技术手段研究了 miR396b的功能。主要研究结果如下:1.miR396b过表达毛状根形态和生长量变化。miR396b过量表达抑制了转基因毛状根生长,使得毛状根的生物量显著降低,为对照毛状根的55.5%;且与对照相比,miR396b过表达毛状根更易脱分化形成愈伤组织;毛状根横切面与纵切面显微照片显示,miR396b过表达毛状根中根尖分生细胞较对照减少。2.miR396b过表达毛状根中丹参酮、丹酚酸和花色素含量检测。（1）miR396b的过表达显著提高了丹参酮含量,丹参酮Ⅰ（TA-Ⅰ）、丹参酮ⅡA（TA-ⅡA）、隐丹参酮（CT）含量分别为对照的1.53、1.84和3.47倍,总丹参酮含量为对照的1.91倍。（2）miR396b过量表达显著降低了丹酚酸含量,迷迭香酸（RA）和丹酚酸B（SAB）的含量分别为对照的64.6%和78.7%,总酚酸类含量为对照毛状根的72.1%。（3）miR396b过表达毛状根中花色素含量显著增加,为对照毛状根的1.44倍。3.miR396b过表达毛状根转录组和small RNA分析。运用de novo RNA-seq对miR396b-OE毛状根的转录组进行研究。分析得到1635个差异表达基因（DEGs）,其中差异表达的萜类途径基因和苯丙烷类途径基因共16个,包括参与GA生物合成相关的SmCPS5和SmGA20ox1。GO（Gene Ontolgoy）富集分析显示,1635个DEGs显著富集于防御和应激反应相关的生物过程,包括非生物信号,如冷、热、温度、光照、渗透、高渗盐度和盐胁迫等。此外,还发现诸多激素合成与代谢相关显著差异表达基因。miR396b过表达毛状根small RNA测序共鉴定到152个miRNAs,其中56个为miR396b-OE与对照毛状根差异表达miRNAs,包括18个显著上调,38个显著下调。4.miR396b靶基因鉴定及表达水平检测。参照转录组与Small RNA测序数据,进行降解组测序分析,结合5’RLM-RACE与qRT-PCR,共鉴定了 13个受miR396b负调控的靶基因,包括SmGRF1-7、SmMYB37、SmMYB4、SmMYB99、SmHDT1、SmnCDase 1和SmLBRP R1B-12。5.miR396及次生代谢相关基因的启动子分析。运用Softberry、PLACE、PlantPan和PlantRegMap在线软件对miR396b启动子区域进行分析,结果显示,miR396b启动子富含ABRE等胁迫响应元件,有1个ZmC1转录因子、1个TCP转录因子（SMil00003982）及1个SmARF1结合位点。对次生代谢相关基因启动子分析发现,多个基因启动子区有SmMYB4、SmMYB37或SmARF1的结合位点。6.酵母单杂交实验。选取12个途径基因启动子片段分别与预测有结合位点的SmMYB4、SmMYB37或SmARF1转录因子进行酵母单杂交实验验证。结果表明,SmMYB4可以结合SmMDC和SmPAL1启动子;SmMYB37可以结合SmC4H启动子。7.外源激素与胁迫对miR396b及其靶基因的转录表达影响。进行了外源激素及盐和干旱胁迫诱导实验,结果表明:（1）外源施加激素脱落酸（Abscisic acid,ABA）、赤霉素（Gibberellin,GA）和茉莉酸甲酯（Methyljasmonate,MJ）均可显著诱导miR396b的转录表达。（2）盐和干旱胁迫条件下,miR396b的表达水平提高,部分靶基因的表达水平显著降低。综上所述,我们推测,smi-miR396b通过其靶基因及其它miRNAs,在丹参的生长发育、胁迫响应和次生代谢等生理活动中发挥重要作用。