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目的暴发性肝衰竭(FHF)是一种以凝血酶原时间延长和肝性脑病为主要特征的临床疾病,而脑水肿继发脑疝是死亡的主要原因。目前研究表明,血管源性脑水肿和细胞毒性脑水肿可能同时参与FHF时脑水肿的形成过程。同时Hill DB等证实了血脑屏障(BBB)通透性增加是FHF引发血管源性脑水肿的主要发病机制。BBB结构中最重要的是紧密连接(TJ)。目前关于TJ分子结构的研究很多,但病理条件下TJ相关蛋白,尤其是对其功能调节蛋白occludin的研究还很少。复方甘草酸苷(Glycyrrhizin)作为强有力的肝细胞膜保护剂,具有保护肝细胞、抗炎、调节免疫、抑制病毒、类固醇激素样等作用。有研究证实复方甘草酸苷可以通过降低细胞因子IL-1、IL-6及TNF-α水平对重症肝炎小鼠发挥保护作用。本研究旨在弄清复方甘草酸苷能否通过改变occludin蛋白的分布或表达来影响血脑屏障的通透性。实验通过观察FHF模型组和Glycyrrhizin处理组occludin蛋白的分布及表达,来揭示复方甘草酸苷降低肝衰竭时血脑屏障通透性的保护作用。材料与方法1、动物模型制备实验动物为400只雄性Balb/c小鼠,随机分为5组。1组:生理盐水对照组,2组:内毒素(LPS)对照组,3组:D氨基半乳糖(GalN)对照组,4组:暴发性肝衰竭模型组(LPS+GalN),5组:保护组(LPS+GalN+Glycyrrhizin)。各组40只小鼠,其中20只检测BBB通透性,另20只留血、脑组织和肝脏组织待检。2、血清ALT水平的测定应用生物化学方法检测血清ALT水平,以明确暴发性肝衰竭时肝脏功能生化学改变。3、EB含量的测定处死动物前2h尾静脉注射伊文思蓝(EB),取脑组织溶于甲酰胺,离心取上清于波长632nm进行比色,根据标准曲线计算出单位脑组织EB含量,以此评价BBB通透性的变化。4、HE染色法观察对留取的肝、脑组织进行HE染色,光镜下观察各组病理形态学改变。5、免疫组化检测应用免疫组化技术检测occludin蛋白在脑组织中的分布与表达。血管内皮细胞胞浆内棕褐色染色,或于细胞浆内沿胞膜有棕褐色线形染色者为阳性细胞。6、Western blot方法应用Western blot方法对occludin蛋白的表达作半定量分析。7、实时定量PCR检测应用Trizol试剂提取脑组织RNA,利用实时定量PCR对occludin mRNA的表达作相对定量分析。采用SYBR Green I荧光染料嵌合法,以构建的RNA为标准品,分别对目的基因(occludin基因)和管家基因(GAPDH)制作标准曲线,利用标准曲线对样品中的目的基因和管家基因分别进行定量。通过管家基因的校正,检测各种样品occludin mRNA的相对表达量。8、数据处理结果用平均数±标准差表示,并采用方差分析的方法,以P＜0.05为差异具有显著性。实验结果1、复方甘草酸苷在FHF动物模型中的作用:LPS/GalN联合注射后动物出现懒动,进食能力下降,9h后血清ALT明显升高,较其它对照组有显著性差异(P＜0.01)。肝脏出现出血性大块或亚大块肝坏死,病理改变类似暴发性肝衰竭,总死亡率达70.6%。应用Glycyrrhizin预先注射,动物死亡率显著下降至40%,血清ALT水平明显降低,肝脏病理变化明显减轻。2、EB含量测定结果暴发性肝衰竭组小鼠脑组织EB含量明显增高,较其它对照组均有显著性差异(P＜0.05);在用Glycyrrhizin预先进行保护后,脑组织中EB含量较暴发性肝衰竭组明显降低(P＜0.05)。3、脑组织HE染色各组脑组织HE染色切片中未发现有明显异常表现。4、脑组织occludin蛋白的表达:利用免疫组化方法检测到在肝衰竭组中,血管内阳性染色明显减弱,甚至在整张切片上很难见到阳性染色信号。在western blot分析中,发现相同组中occludin蛋白的表达量减弱,经过Glycyrrhizin预先进行保护后,脑组织内免疫组化阳性染色信号明显增加,western blot分析也表明蛋白表达量明显增加。5、脑组织occludin mRNA的表达利用荧光定量PCR法检测occludin mRNA的相对含量,各组之间无显著性差异结论1、复方甘草酸苷预保护可阻断小鼠FHF的发生,证明复方甘草酸苷对暴发性肝衰竭小鼠有保护作用。2、复方甘草酸苷组脑组织EB含量较FHF组显著降低,证明复方甘草酸苷能预防血脑屏障通透性的增加。3、复方甘草酸苷组脑组织occludin蛋白表达较FHF组明显增加,提示紧密连接蛋白occludin的表达上调是复方甘草酸苷对FHF血脑屏障产生保护的可能机制。