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实验背景：低浓度的全身性炎症反应在肥胖相关炎症疾病如胰岛素抵抗及主动脉粥样硬化病变发展过程中起关键作用,并且与代谢综合征的发生呈相关性。高脂肪饮食(HFD)能影响肠道通透性,引发全身性炎症刺激因子的聚集,这些刺激因子包括了白介素-1受体(IL-1R)/toll样受体(TLRs)的内源性与外源性配基。并且已有既往研究证实了IL-1R/TLRs信号通路在高脂饮食致全身性炎症反应及肥胖致炎症疾病发展中均起着关键作用。实验目的：本研究中,我们旨在探索TLR-MyD88(髓样分化因子88,myeloid differentiation factor88, IL-1R/TLRs主要衔接分子)信号通路是如何在不同细胞类型中协调性地参与HFD诱导的全身性炎症反应及代谢性炎症疾病的起始阶段。实验方法：我们应用Cre-LoxP基因敲除技术得到内皮细胞特异性MyD88基因敲除小鼠(MyD88EC-KO)及骨髓/巨噬细胞特异性MyD88基因敲除小鼠(MyD88MC-KO).我们又将MyD88EC-KO小鼠与MyD88MC-Ko小鼠与载脂蛋白E基因敲除小鼠(ApoE-/-)杂交得到MyD88EC-KO ApoE-/-小鼠和MyD88MC-KO ApoE-/-小鼠.这些小鼠被给予正常饮食或高脂饮食(HFD,从小鼠6周大开始)三个月以建立饮食致肥胖模型及主动脉粥样硬化疾病模型。我们对实验小鼠检测了包括体重、体脂肪量、血脂水平及血糖/胰岛素浓度等代谢指标,同时应用葡萄糖/胰岛素耐量试验来评估其对胰岛素的敏感性。我们向小鼠腹腔注射胰岛素或生理盐水后收集脂肪组织、肌肉组织及肝脏组织,并用western-blot检测胰岛素对IRS-1-PI3K-AKT信号通路的激活。为了检测HFD诱导的全身炎症反应,用ELISA检测血浆内促炎症细胞因子的蛋白水平。通过免疫组化染色观察实验小鼠脂肪组织中巨噬细胞的浸润量,且进一步对基质血管成分细胞染色并予以细胞流式分析巨噬细胞亚型。在主动脉粥样硬化模型中,对实验小鼠主动脉进行油红O染色,用photoshop软件分析图像并计算各基因组平均病变面积。通过免疫荧光染色结合共聚焦显微镜检查病灶内巨噬细胞-粒细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)与内皮细胞表面标记CD31共定位。我们建立脂肪细胞和巨噬细胞共培养的方法并且用游离脂肪酸(FFAs)/细菌脂多糖(LPS)刺激巨噬细胞来证实巨噬细胞及脂肪细胞间的相互作用。另一方面,我们提取氧化低密度脂蛋白(oxided low density lipo-ptortein, ox-LDL)刺激后内皮细胞的上清液培养单核/巨噬细胞或直接用ox-LDL刺激GM-CSF促分化的巨噬细胞而阐明内皮细胞及巨噬细胞间的相互作用。上述实验中,RT-PCR用来检测组织/细胞中炎症基因及M1/M2巨噬细胞亚型标志基因的表达水平,而western-blot用来分析各信号通路的激活程度。实验结果：在高脂饮食小鼠模型中,对骨髓细胞来源MyD88基因的特异性敲除(MyD88MC-KO)能降低全身性炎症反应、胰岛素抵抗及主动脉粥样硬化的程度,同时也能减少脂肪组织中巨噬细胞(ATM)的浸润及ATM从M2抗炎症巨噬细胞亚型向M1促炎症亚型的转变。在此基础上,我们进一步证实了巨噬细胞和脂肪细胞间存在相互作用,而脂肪细胞通过巨噬细胞内MyD88介导的信号通路诱导其M1相关基因的表达。另一方面,内皮细胞特异性敲除MyD88基因小鼠(MyD88EC-KO)体内M1亚型ATM数量,全身炎症反应及主动脉粥样硬化程度与对照组小鼠相比也有一定程度的降低,但不及MyD88MC-KO小鼠表型明显。同时体内及体外实验均表明,内皮细胞来源MyD88依赖生成的GM-CSF因能促使脂肪组织及主动脉组织内巨噬细胞极化为M1亚型而在肥胖致全身性炎症反应及主动脉粥样硬化发展的起始阶段扮演着重要角色。实验结论：总而言之,这些结果都证明了MyD88介导的信号途径在高脂饮食诱导全身性炎症反应及代谢性炎症疾病发生发展的过程中对脂肪细胞、巨噬细胞及内皮细胞三者间相互联系起着关键作用。