骨骼是一个高活性组织,通过不断的改建和重塑来维持其矿化平衡及自身的结构完整。大量研究证实,氟可干扰成骨和破骨活动及胶原代谢,进而表现出强烈的骨骼毒性。短链脂肪酸是肠道菌群发酵膳食纤维的主要产物,在调控骨骼代谢方面具有重要作用。课题组前期研究发现高氟可以导致小鼠肠道菌群紊乱,并降低结肠短链脂肪酸的含量。本研究模拟自然环境氟暴露实际,通过在饮水中添加不同剂量氟化钠建立氟暴露大鼠模型,采用micro-CT、HE染色、Goldner染色、Von Kossa染色、TRAP染色、甲苯胺蓝染色和天狼猩红染色等病理形态学技术评价过量氟暴露对大鼠骨组织、骨细胞及骨微结构等影响;采用免疫荧光化学、免疫组织化学及多种分子生物学方法研究氟致大鼠骨损伤的分子机制。另外,在氟暴露大鼠饮水中添加短链脂肪酸,建立短链脂肪酸干预的氟暴露大鼠模型,采用HE、AB-PAS、PAS、TUNEL、免疫组化、免疫荧光染色和16S rRNA高通量测序技术,分析补充短链脂肪酸对氟诱导肠屏障损伤、菌群紊乱及骨损伤的影响。最终为阐明氟致大鼠骨损伤的作用机制及氟骨症治疗提供理论基础。研究结果如下:1.氟暴露对大鼠股骨微结构及骨转换的影响采用micro-CT技术对大鼠股骨进行三维扫描成像,结果显示过量氟暴露导致骨小梁数量显著增多并且小梁间孔隙减少,骨髓腔隙变窄甚至消失。进一步对骨参数分析发现,氟暴露后骨体积分数（BV/TV）、骨矿物质密度（BMD）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁数量（Tb.N）均显著增加（P＜0.05,P＜0.01）,并且结构模型指数（SMI）和骨小梁分离度（Tb.Sp）显著降低（P＜0.05,P＜0.01）;经免疫荧光化学和TRAP染色检测发现,过量氟导致成骨细胞标志物ALP显著增加（P＜0.05,P＜0.01）,添加50和100 mg/L的氟均显著提升了大鼠股骨干骺端破骨细胞数量（P＜0.01）。以上结果表明,过量氟严重破坏大鼠股骨骨微结构,加速骨转换,导致骨硬化。2.氟暴露对大鼠股骨组织形态学的影响HE染色结果显示,氟暴露导致大鼠骨小梁形态异常,表现为骨小梁增粗、扩大并和邻近小梁融合成片,并且还造成骨细胞模糊,溶解,甚至消失;Goldner和Von Kossa染色发现,氟暴露导致股骨内矿化骨和钙盐沉积面积显著增加（P＜0.01）;甲苯胺蓝染色对股骨生长板和关节软骨进行观察发现,过量氟导致大鼠生长板增厚（P＜0.01）,在氟100组内出现了生长板的骨化甚至断裂,且氟损伤关节软骨导致软骨细胞着色变淡,大量细胞萎缩,在氟100组中尤为明显;免疫荧光对股骨内Ⅱ型胶原表达进行检测,结果发现过量氟暴露后Ⅱ型胶原在关节软骨、生长板软骨细胞和骨小梁中表达均显著增加（P＜0.01）;天狼腥红染色检测Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维的表达,结果显示过量氟暴露导致骨小梁内Ⅰ型胶原表达显著降低,Ⅲ型胶原表达显著增加,并且导致胶原纤维走向异常、排列紊乱。上述结果表明,过量氟暴露严重损伤股骨骨小梁、生长板、关节软骨和骨胶原纤维,这可能是氟造成骨损伤的主要病理学原因。3.氟暴露诱导自噬紊乱并激活Wnt/β-catenin信号通路免疫组化检测发现,氟暴露诱导HIF-1α表达显著增加（P＜0.05,P＜0.01）,而CD31和VEGF结果显示其表达量在氟暴露后显著降低,且与氟暴露呈现剂量依赖性（P＜0.01）。采用免疫荧光检测氟暴露后自噬和Wnt/β-catenin信号通路相关分子的表达,结果显示氟暴露后自噬的标志物Beclin1和LC3水平显著升高（P＜0.01）;ATG5和ATG7共同参与自噬泡的形成,在氟暴露后其表达水平也显著升高（P＜0.05,P＜0.01）;p62作为自噬特异性底物,结果表明p62的表达水平在氟50组和氟100组中显著升高（P＜0.01）。进一步评价氟对Wnt/β-catenin通路相关分子的影响,结果发现过量氟诱导Wnt配体（Wnt3a）表达水平显著升高（P＜0.01）;β-catenin是Wnt信号通路的主要转录激活物,在氟暴露后也显著增加（P＜0.01）;Cyclin D1、C-myc和Runx2作为Wnt信号转导的下游靶基因,参与成骨细胞的增殖和分化,结果显示氟暴露后Cyclin D1、C-myc和Runx2的表达均显著增加（P＜0.01）。以上结果表明过量的氟抑制骨血管生成,增强HIF-1α信号转导,导致自噬紊乱和Wnt/β-catenin信号通路激活,进而参与骨损伤进程。4.补充短链脂肪酸对氟诱导菌群紊乱及骨损伤的影响采用HE、AB-PAS、PAS和免疫组化染色观察结肠组织结构、杯状细胞、糖蛋白和粘蛋白2的表达,评估补充短链脂肪酸对氟暴露大鼠结肠病理形态学和黏液屏障的影响,结果显示补充短链脂肪酸能缓解氟诱导结肠病理形态学及黏液屏障损伤。进一步采用免疫荧光染色观察补充短链脂肪酸对氟中毒大鼠结肠细胞间紧密连接蛋白（Occludin、ZO-1）和增殖相关蛋白（CyclinD1、C-myc）的表达,结果显示补充短链脂肪酸缓解氟诱导细胞间紧密连接损伤及增殖抑制。通过TUNEL检测结肠细胞凋亡,发现补充短链脂肪酸缓解氟诱导结肠细胞凋亡。肠道菌群16S rRNA高通量测序分析结果显示,氟暴露后大鼠结肠微生物菌群的结构和多样性显著改变,而补充短链脂肪酸能够缓解氟造成结肠菌群组成及多样性改变。LEf Se（LDA Effect Size）分析结果显示,丰度差异较大的物种一共有23个（LDA值＞4）。进一步对门水平和属水平上结肠菌群进行组间差异显著性检验发现,氟暴露导致厚壁菌门、罗姆布茨菌属、双歧杆菌属和费氏杆菌属的丰度显著降低（P＜0.01）,并且导致拟杆菌门、弯曲杆菌门、普雷沃氏菌属、布劳特氏菌属和普雷沃氏菌科＿UCG＿001菌属的丰度显著升高（P＜0.05,P＜0.01）。补充短链脂肪酸在一定程度上能缓解紊乱的菌群丰度。HE染色结果发现,氟暴露后骨小梁扩大并相互融合。补充短链脂肪酸后,骨小梁呈条状或带状,相互融合的骨小梁减少。上述结果提示肠屏障损伤及菌群紊乱在氟诱导的骨损伤中起重要作用,补充短链脂肪酸能通过缓解肠屏障损伤和菌群紊乱,进而改善氟诱导的骨损伤。综上所述,过量氟暴露严重损伤股骨形态结构,诱发自噬紊乱和Wnt/β-catenin信号通路激活,从而引起异常骨形成增加,导致硬化型氟骨症。补充短链脂肪酸能通过缓解肠屏障损伤和菌群紊乱,进而改善氟诱导的骨损伤。本研究为氟的骨骼毒性及氟骨症治疗提供理论基础。