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背景与目的 胎盘对哺乳动物胚胎发育至关重要,其完整性和正常功能依赖于众多基因的精确调控。子痫前期是妊娠期特发性疾病,发病机制至今尚未完全阐明。众多研究表明,子痫前期是一种胎盘源性疾病,胎盘病理变化主要表现为滋养细胞凋亡、过度自噬以及侵袭能力降低等,这些变化会导致胎盘“浅着床”和胎盘血管重铸障碍,最终导致胎盘灌注不良和胎盘组织缺氧。合胞素在胎盘滋养细胞中特异性表达,它能够特异性地介导细胞滋养层细胞融合形成合体滋养层细胞。研究证实,子痫前期胎盘中合胞素表达降低,且降低程度与疾病严重程度呈正相关。除细胞融合功能外,合胞素还通过非融合功能参与滋养细胞生物学功能的调控,继而参与子痫前期的发生。本研究拟从合胞素入手,探究其对滋养细胞生物学功能的影响在子痫前期发病中可能的作用机制。材料与方法1.合胞素在PE滋养细胞模型和sPE孕产妇胎盘中的表达分析1.1使用实时荧光定量PCR和免疫印迹分别检测对照组与PE滋养细胞模型中Syncytin-1的mRNA和蛋白表达水平;1.2使用免疫印迹检测对照组与PE滋养细胞模型中凋亡蛋白的表达水平;1.3正常及sPE孕产妇胎盘组织形态学分析;1.4使用免疫印迹检测正常及sPE孕产妇胎盘中凋亡蛋白的表达水平。2.条件性诱导syncytin-a基因敲除对胎鼠及胎盘发育的影响构建条件性诱导syncytin-a基因敲除小鼠,使用实时荧光定量PCR检测胎盘中syncytin-a基因的敲除效率。2.1孕鼠表型:使用CCB法检测将对照组及诱导组孕鼠尿蛋白进行定量检测;2.2胎鼠及胎盘表型:使用体视镜记录各时间点（E14.5～18.5 d）胎鼠和胎盘表型;2.3胎鼠形态学分析:使用H＆E染色观察胎鼠形态变化;2.4使用罗丹明123积累实验检测胎盘转运能力;2.5胎盘形态学分析:使用H＆E染色、免疫组化染色、免疫荧光染色及透射电镜观察各时间点（E14.5～18.5 d）胎盘组织形态学变化;2.6胎盘血管形成分析:使用免疫荧光染色观察胎盘中血管形成情况,使用实时荧光定量PCR检测胎盘中PLGF、VEGF及s Flt-1的mRNA表达变化;2.7胎盘细胞凋亡分析:使用TUNEL染色检测胎盘中细胞凋亡情况,使用免疫印迹检测胎盘中凋亡蛋白表达水平。3.合胞素对滋养细胞生物学功能影响同时在BeWo和HTR-8/SVneo滋养细胞中转染HERV-W siRNA,构建HERV-W基因敲除细胞,使用实时荧光定量PCR和免疫印迹鉴定细胞中Syncyitn-1的mRNA及蛋白表达水平变化。3.1使用体外小管形成实验评估滋养细胞中Syncytin-1敲除对血管形成能力的影响,通过实时荧光定量PCR及ELISA检测血管生成相关因子PLGF、VEGF及s Flt-1的mRNA及蛋白表达变化;3.2使用MTT实验检测Syncytin-1对滋养细胞增殖的影响,使用实时荧光定量PCR检测增殖标志分子PCNA及Ki-67的mRNA表达变化;3.3使用TUNEL染色检测Syncytin-1对滋养细胞凋亡的影响,使用免疫印迹检测凋亡蛋白表达水平;3.4使用免疫印迹检测Syncytin-1对滋养细胞自噬标志蛋白LC3B表达的影响,使用实时荧光定量PCR检测自噬相关基因Atg7、Atg4B及Beclin1的mRNA表达变化;3.5通过Transwell迁移和侵袭实验检测Syncytin-1对滋养细胞迁移和侵袭能力的影响,使用细胞划痕实验检测滋养细胞迁移能力变化,使用实时荧光定量PCR检测侵袭相关基因MMP2、MMP9及TIMP的mRNA表达变化;3.6使用免疫印迹检测EMT相关蛋白E-cadherin和Vimentin的表达变化;3.7通过实时荧光定量PCR检测Syncytin-1对滋养细胞TNF-α和IL-10炎性细胞因子mRNA表达的影响;结果1.在PE滋养细胞模型中,Syncytin-1的表达较正常对照组明显下调;sPE孕产妇胎盘较正常胎盘形态学变化显著,MVD明显减少,凋亡细胞显著增加。同时发现PE滋养细胞和sPE孕产妇胎盘中凋亡蛋白表达增加。2.条件性诱导syncytin-a基因敲除小鼠胎盘发育不良,胎盘血管形成障碍,滋养细胞凋亡,母胎间物质交换异常,继而导致胎鼠宫内致死。3.体外实验研究发现,Syncytin-1表达下调可抑制体外血管形成,且会抑制滋养细胞中PLGF和VEGF的表达,促进s Flt-1的表达。同时Syncytin-1表达下调明显抑制了滋养细胞的增殖能力,PCNA和Ki-67的mRNA表达水平显著降低;滋养细胞凋亡增加,且依赖于Caspase通路;滋养细胞自噬增加,Atg7、Atg4B及Beclin1的mRNA表达水平均升高;滋养细胞的迁移侵袭能力下降,MMP2、MMP9及TIMP的mRNA表达水平均下调;此外,滋养细胞中Vimentin表达水平显著下调,E-cadherin表达无变化,提示Syncytin-1表达下调可能参与了EMT过程;Syncytin-1表达下调促进了滋养细胞中TNF-α的表达,同时下调IL-10的表达。结论 本研究发现,PE滋养细胞模型中Syncytin-1表达下调,且细胞凋亡显著增加。体内实验结果表明,敲除syncytin-a基因会引发胎盘发育不良,抑制胎盘血管生成,最终导致胎鼠宫内致死;体外实验结果进一步证实,Syncytin-1通过调控血管生成及滋养细胞增殖、侵袭、迁移、EMT等过程参与PE的胎盘病变。