研究背景阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种与衰老相关的、以不可逆的脑组织退行性变性为特征的中枢神经系统疾病,为临床上老年痴呆症的主要病因。在临床上,AD病人主要表现为明显的记忆力和理解力减退,逐渐患有语言障碍和精神错乱,进而可以发展到对事物和空间辨别能力的丧失,以及情绪失控和拒绝家人帮助等情况。在大体病理学上,AD病人通常有整个大脑的明显萎缩,表现为体积变小、重量减轻及皮层变薄等特征。在显微病理学上,可以观察到在神经元之间的淀粉样斑块（amyloid plaques,Aβ）、在神经元内的Tau蛋白（一种微管相关蛋白）过度磷酸化而引起的神经纤维缠结（neurofibrillary tangles）,以及弥漫性的炎性坏死病灶和神经元大量死亡等特征性改变。自上世纪80年代,从Aβ斑块和Tau蛋白过度磷酸化的病理学特征角度而形成了“淀粉样蛋白级联假说”（amyloid cascade hypothesis）和“Tau蛋白过度磷酸化假说”（Tau hyperphosphorylation hypothesis）。然而,直到今天,基于这两个主流假说而兴起的关于AD治疗的药物都未取得成功。这一情况提示,基于这两种病理学特征对于AD发病机制的理解可能还是很局限的。而且,也暗示了AD发生发展的机制是非常复杂的。所以,对于AD的研究和治疗越来越成为该领域的热点问题,从而引发了许多从不同角度对于AD的研究。细胞粘附分子L1（cell adhesion molecule L1,L1）是一种主要表达于神经细胞的质膜上的跨膜蛋白。在中枢神经系统中,它可以参与神经元之间的相互识别和连接。本实验室的前期研究发现,以腺病毒介导的全长L1分子在AD模型小鼠的海马组织中（L1的表达本来是降低的）的高表达,可以有效地促进Aβ斑块的清除。进而也发现,在野生型小鼠的海马组织中全长的L1可以被剪产生一个分子量70 k Da的片段（称L1-70）,并发现它经过一定的分子修饰后可以进入细胞核内。然而,关于AD模型小鼠海马组织中L1的高表达可以促进Aβ斑块清除的细节,以及其与L1的切割片段L1-70的关系,则尚不清楚。研究目的基于我们实验室从不同角度对于L1的生物学特性的研究积累,我们意识到了“L1促进Aβ清除的机制并非是全长L1分子的直接作用,而是其切割片段L1-70发挥作用的结果”的可能性。于是,我们提出了“在神经细胞内,全长的L1可以被特异性地剪切而产生L1-70,该切割片段L1-70可以通过某种特定的形式调控某些特定基因的表达,进而调控脑组织内具有吞噬功能的胶质细胞的活动,由此而促进Aβ的清除”的科学假设。研究方法为了验证这一假设,本课题采用“追踪L1的切割片段L1-70在神经细胞功能活动中的行为方式”的基本策略来探讨L1-70与Aβ清除之间的相关性。所采用的研究方案是:首先,利用Western blotting技术及免疫荧光组织化学技术分析野生型小鼠和AD模型小鼠的神经细胞中L1和L1-70的表达,以及Aβ斑块沉积的情况,以希望了解它们的表达特性及其之间的相关性。然后,采用Parabiosis联体小鼠的研究系统,在老年AD模型小鼠与年轻野生型小鼠联体后的不同时间点（联体3天和14天）,取老年AD小鼠的海马组织,在蛋白质水平和组织水平分析L1和L1-70的表达,以及Aβ斑块沉积的程度是否发生改变,以了解神经细胞中L1和L1-70的表达是否受到体液微环境的影响,以及其与Aβ斑块沉积的相关性。进而,以针对L1胞内段的抗体,分别采用Co IP技术,免疫荧光染色技术和ELISA技术分析L1-70在神经细胞中的存在形式,以了解L1-70是否与其它特定分子相结合而形成复合物的情况。然后,采用Duolink技术,原位验证其复合物是直接结合存在的,以及其在神经元细胞内的空间分布。随后,再以针对L1胞内段的抗体,采用Chip-sequencing的方法,分析L1-70在神经细胞内可以直接地与哪些基因的调控顺序相结合,并分析所调控基因的表达水平,以希望能够发现L1-70在神经细胞中可以调控“具有Aβ吞噬功能的细胞的活动”的相关基因。进而,采用免疫荧光组织化学的方法,原位地分析所发现的相关基因的表达产物对于特定的“具有Aβ吞噬功能的细胞”的调控作用。最后,也将采用常规的分子生物学和细胞生物学方法,对血清中参与神经细胞中L1-70表达调控的相关因子进行一些初步的探讨,找到从年轻小鼠中转移到老年AD小鼠体内引起反应变化的相关循环因子。基于这些研究,以希望能够明确小鼠海马组织中“L1-70与Aβ斑块清除”之间的关系,并阐明其参与Aβ斑块清除的调控机制。研究结果本课题的研究发现,在老年AD模型小鼠海马组织中全长的L1分子呈低表达状态,L1-70也相应地呈低表达状态,同时伴有明显的Aβ斑块沉积的现象。这些结果,提示了L1以及其切割片段L1-70与Aβ斑块沉积是有相关性的。根据我们实验室之前关于“在小鼠大脑组织中有L1-70的存在,并且可以进入细胞核内”的发现,本课题将研究的目标聚焦到了在AD模型小鼠大脑组织中“L1-70的表达水平降低”的这一现象。于是,采用了联体共生小鼠的研究体系,将老年AD模型小鼠（18月龄）与年轻C57BL/6野生型小鼠（2月龄）进行联体,并让它们共同生活一段时间后,发现其联体中的老年AD小鼠的海马组织中的“内源性L1-70的表达水平”出现了明显升高的改变,并在这种小鼠的海马中观察到了“Aβ斑块沉积减少”的现象。在此基础上,我们进一步探讨了L1-70在老年AD小鼠海马组织中的生物学行为。首先,根据我们实验室前期关于“全长L1分子可能结合的相关蛋白”的质谱分析信息,以出生后5～7天的野生型小鼠的脑组织总蛋白为材料,采用Co IP和ELISA的方法,对候选蛋白中的“结合可能性较高”的拓扑异构酶1（Topoisomerase1,Top1）进行了重点分析,并证明了L1-70确实具有与Top1相互结合的特性。随后,采用Duolink方法,从分子水平证明了L1-70确实可以与Top1相互结合而形成复合物（即“L1-70/Top1”）,并存在于神经细胞的细胞核内。进而,采用Chip-sequencing方法,发现了一些可能受L1-70/Top1复合物调控的候选基因。基于已有关于“胶质细胞可以直接参与大脑组织中Aβ斑块沉积清除”的知识,以及相关炎症因子等方面的考虑,我们从所发现的这些候选基因中,集中地分析了巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhibitory factor,MIF）的表达与小胶质细胞功能活动的关系。研究发现,当18月龄AD模型小鼠与年轻野生型小鼠联体3天后,AD模型小鼠海马组织中的L1-70的表达水平表现为明显升高,并发现在其Aβ斑块的周围有大量的小胶质细胞成簇聚集的现象。而且发现,其AD模型小鼠的大脑组织中的MIF的表达水平相对于非联体的AD模型小鼠大脑组织中的MIF水平是明显升高的。当继续联体14天后,便发现在AD模型小鼠的海马组织中的Aβ沉积相对于联体3天时Aβ沉积的程度出现了减少的现象。基于已有的关于“MIF可以活化小胶质细胞并促进Aβ清除”的知识,这些结果不仅在活体内进一步证实了L1的切割片段L1-70的高表达可以促进Aβ斑块的清除,而且从逻辑上也提示了L1-70可能是通过“调控MIF的高表达,活化小胶质细胞”的机制来实现大脑组织中Aβ清除的。在此基础上,本课题也对血清中可能调控L1表达的相关因素进行了探讨。根据Geismann实验室关于“肿瘤组织中L1的表达受TGFβ-1调控”的研究提示,我们试探性地分析了在老年AD模型小鼠与年轻野生型小鼠的联体中,其老年AD模型小鼠大脑组织中“L1-70表达水平升高”的现象是否是由于“高水平存在于其年轻野生型小鼠血液中的TGFβ-1作为循环因子通过毛细血管转移到老年AD模型小鼠体内,以致其老年AD模型小鼠血液中TGFβ-1的水平明显提高,由此而通过某种特定的机制以调控神经细胞内L1-70表达”的可能性。首先,我们采用ELISA方法,证明了在其联体小鼠中的老年AD模型小鼠的血清中的TGFβ-1水平相对于非联体的老年AD模型小鼠的血清中的TGFβ-1水平是显著升高的。进而,我们在体外培养的N2a细胞中,采用si RNA技术,将TGFβ-1的表达Knock-down后,发现L1-70和MIF的表达水平都随之降低。这些结果,提示了血清中的TGFβ-1参与了神经细胞中L1-70表达的调控的可能性。研究结论基于这些结果,并结合目前已有的关于L1生物学特性的认识,本课题提出了一个全新的关于L1-70参与AD模型小鼠海马组织中Aβ斑块清除机制的模型,即:“位于神经元细胞膜上的L1,经丝氨酸依赖的蛋白酶的特性切割而产生L1-70,并通过内吞的方式而进入胞内——L1-70与Top1结合而形成复合物L1-70/Top1,并通过核孔而进入核内,调控MIF基因的表达——MIF蛋白通过活化小胶质细胞的方式,进而促进Aβ斑块的清除”。同时,基于“老年AD模型小鼠的脑组织中L1-70的表达是低的、其血液中TGFβ-1的水平也是低的,以及将其血液中的TGFβ-1水平调高后便可提高脑组织中L1-70表达”的结果,本课题提出了“TGFβ-1有可能作为从衰老角度探讨AD发病机制的一个切入点”的科学设想。研究意义本课题在科学上的创新点主要有:1)首次揭示了L1-70在AD模型小鼠的海马组织中呈低表达状态的现象,以及其与Aβ斑块沉积现象的伴随关系;2)首次阐明了在AD模型小鼠的海马组织中L1-70促进Aβ斑块清除的调控机制;3)首次发现了体液微环境中的TGFβ-1可以调控神经细胞中L1-70的表达,进而促进Aβ斑块的清除。本课题所取得的这些进展,为AD发病机制的探讨提供一个新的视角,也为临床上AD的防治研究提供一个新的思路。