流行病学资料表明,2型糖尿病患病率随年龄增加而上升。胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)和胰岛β细胞功能受损是2型糖尿病的主要发病机制。IR是由于肝脏、脂肪和肌肉等组织对胰岛素生物效应的反应性降低而产生的一系列临床表现。大量的研究已经表明IR是大多数2型糖尿病患者始动因素。随着年龄的增长,IR的发生呈增高趋势,对于IR发病率随增龄而增加的机制目前还不清楚。遗传因素和环境因素均可诱导IR的发生。研究发现,老年内脏脂肪增加使2型糖尿病和心血管发病率增加,其中饮食是重要促发因素之一。长期高脂饮食的人群IR和2型糖尿病发病率明显高于正常人群,动物实验也证实,高脂环境可以损害骨骼肌、肝脏和脂肪在内的多种胰岛素靶器官的胰岛素敏感性。目前认为高脂环境是诱发IR的独立危险因素之一。骨骼肌是机体葡萄糖、脂质摄取和利用的重要器官。从人和动物的研究中有充分的证据表明在肌肉中脂肪酸代谢异常与胰岛素敏感性有关,骨骼肌细胞内脂质含量增加可引起骨骼肌胰岛素抵抗。脂肪酸的摄入增加和/或氧化减少会导致肌内甘油三酯的积累。骨骼肌细胞膜脂肪酸转运蛋白(fatty acid translocase, FAT/CD36)表达增加被认为有易于长链脂肪酸的转运,是肌肉清除血中脂肪酸增多的原因,与胰岛素抵抗相关疾病联系紧密。研究发现,老年脂肪酸氧化能力下降,可能是导致年龄相关的肌内脂肪堆积原因之一。肉碱棕榈酰转移酶Ⅰβ(carnitine palmitoyltransferaseⅠβ, CPTⅠβ)是骨骼肌脂肪酸进入线粒体进行β氧化的限速酶,是控制能量代谢的关键因素,CPTⅠβ功能缺陷会导致长链酯酰CoA在胞浆过多积聚。骨骼肌为什么随年龄的增长而脂肪堆积增加,目前还不清楚,是否与随年龄的增加这些组织中脂肪酸转运的关键环节发生障碍有关,目前国内外还未见报道。胰岛素刺激组织摄取利用葡萄糖是通过胰岛素受体-胰岛素受体底物1-磷脂酰激醇-3激酶-蛋白激酶B(PKB)等一系列信号传导过程完成的,最终使葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)转移到细胞膜,大量GLUT4的膜转移可加速葡萄糖摄入到细胞内。胰岛素信号转导通路中任一步骤的异常都可能最终阻碍骨骼肌转运葡萄糖,从而引起IR。在青年大鼠有研究发现骨骼肌内脂质代谢中间产物的堆积干扰了胰岛素信号转导的某些环节,但增龄引起的肌内脂肪积聚是否与胰岛素刺激的葡萄糖摄入的关键环节异常有关,目前报道较少。噻唑烷二酮类药物罗格列酮是人工合成的过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators activated receptorγ,PPARγ)高亲和力配体,是一类由配体激活的新型降糖药物。罗格列酮可以通过多种途径增加胰岛素敏感性,改善IR。有研究发现PPARγ与肌肉组织中脂肪酸转运蛋白的表达密切相关,但具体机制还有待进一步阐明。本课题通过观察老年大鼠和给予高脂饮食喂养后骨骼肌脂肪酸代谢情况,研究骨骼肌中脂肪酸转运关键酶FAT/CD36和CPTⅠβ的表达及胰岛素信号转导通路中PKB和GLUT4的表达,探索老年大鼠骨骼肌脂肪酸转运有关的代谢异常与IR形成的机制;通过对高脂喂养老年大鼠罗格列酮药物干预,探讨罗格列酮改善IR的新机制,为改善老年IR状态、降低糖尿病的发生和延缓衰老提供一个新的研究方向。本实验内容主要包括以下四部分:第一部分高脂饮食对老年大鼠骨骼肌脂肪酸代谢和胰岛素敏感性的影响及罗格列酮的干预研究目的:探讨老年和高脂饮食及罗格列酮干预对大鼠胰岛素敏感性和骨骼肌内脂质的影响,并对骨骼肌内脂质与胰岛素抵抗进行相关性分析。方法:22-24月龄老年雄性Wistar大鼠40只随机分为2组:老年对照(OC)组16只、高脂(HF)组24只, 4-5月龄青年大鼠16只,为青年对照组(YC)。对照组给予基础饲料,热量组成:碳水化合物65.5%,脂肪10.3%,蛋白质24.2%,总热量为348kcal/100g;HF组给予高脂饲料,其热量组成:碳水化合物20.1%,脂肪59.8 %,蛋白质20.1%,总热量为501kcal/100g;给予老年两组大鼠每日等热量投喂饲料,每周称体重1次,喂养八周。于喂养第四周末心脏采血测空腹血糖(FBG),胰岛素(INS),血清甘油三酯(TG),血清总胆固醇(TC),游离脂肪酸(FFA)的含量。喂养四周末,每组均随机选8只行口服葡萄糖耐量实验(OGTT)评价大鼠对葡萄糖负荷的耐受情况,行高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验判断胰岛素抵抗情况,判断造模成功后高脂组随机分为2组:高脂组和罗格列酮干预组(RSG),每组8只,除继续给予高脂饲料外RSG组给予罗格列酮3mg/kg灌胃,高脂组给予等量生理盐水灌胃,继续喂养四周。实验第八周末,行OGTT实验和高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验评价各组胰岛素抵抗情况,实验前抽取血样用于测定血清各项指标;实验结束后颈动脉放血处死动物,立即取出股四头肌和脂肪组织放入液氮中冷冻,然后保存于-70℃低温冰箱。骨骼肌甘油三酯(TGm)经氯仿/甲醇抽提后用全自动生化分析仪测定,骨骼肌长链酯酰辅酶A(LCACoA)用荧光分光光度计测定。结果:1各组一般项目的比较:与青年组相比,老年组大鼠体重增加,高脂组和罗格列酮干预组体重与老年组相比变化不明显,差异无统计学意义(p>0.05)。与青年组相比,老年组空腹胰岛素、空腹血糖和游离脂肪酸在喂养第八周均升高;与老年组比较,高脂组空腹胰岛素、空腹血糖、游离脂肪酸、总胆固醇和甘油三酯明显升高;罗格列酮干预组空腹胰岛素、空腹血糖、游离脂肪酸、总胆固醇和甘油三酯与高脂组比较均下降,差异均有统计学意义(p<0.05或p<0.01)。2在第四周和第八周,与青年组相比,老年组TGm和LCACoA含量明显升高(p<0.05);与老年组相比,高脂组TGm和LCACoA含量进一步明显升高,且随喂养时间的延长,高脂组喂养第八周TGm和LCACoA含量明显高于第四周(p<0.05或p<0.01);罗格列酮干预组TGm和LCACoA含量与高脂组相比明显下降(p<0.05或p<0.01)。3胰岛素抵抗的评价:在喂养第四周和第八周,与青年组相比,老年组钳夹实验的葡萄糖输注率降低(p<0.01);与老年组相比,高脂组葡萄糖输注率明显下降;随喂养时间延长,第八周时高脂组内葡萄糖输注率与第四周相比明显下降(p<0.01);罗格列酮干预组葡萄糖输注率与高脂组相比明显升高(p<0.01)。4 OGTT实验结果:与青年组比较,无论第四周或第八周老年组大鼠60′、120′血糖和葡萄糖曲线下面积(AUC)均升高(p<0.05或p<0.01)。与老年组比较,高脂喂养第四周120′血糖和AUC升高,高脂喂养第八周各时间点血糖和AUC均升高,差异有统计学意义(p<0.01);高脂喂养第八周0′、60′、120′血糖和AUC明显高于第四周,罗格列酮干预组各时间点血糖和AUC均下降,差异有统计学意义(p<0.05或p<0.01)。5相关结果表明:葡萄糖输注率与空腹胰岛素、游离脂肪酸和骨骼肌甘油三酯和长链脂酰辅酶A明显负相关(p<0.05或p<0.01)。结论:1老年大鼠骨骼肌甘油三酯和长链脂酰辅酶A含量明显高于青年大鼠,葡萄糖输注率和口服糖耐量在老年组明显减低,表明老年大鼠更易发生骨骼肌脂肪堆积和胰岛素抵抗。2高脂饮食可诱导老年大鼠骨骼肌甘油三酯和长链脂酰辅酶A含量进一步升高,葡萄糖输注率和口服糖耐量进一步降低,说明高脂饮食可加重老年骨骼肌脂肪酸代谢异常及胰岛素抵抗。3相关分析表明葡萄糖输注率和骨骼肌脂质明显负相关,说明脂代谢紊乱参与了年龄和饮食诱导的胰岛素抵抗的发生。4罗格列酮可以降低高脂诱导老年胰岛素抵抗大鼠骨骼肌甘油三酯和长链脂酰辅酶A含量,使OGTT各点血糖和AUC下降及增加葡萄糖输注率,改善胰岛素抵抗。第二部分高脂饮食和罗格列酮干预对老年大鼠骨骼肌FAT/CD36和CPTⅠβ表达的影响目的:探讨是否随年龄增长及高脂的环境因素影响了骨骼肌脂肪酸转运的关键酶FAT/CD36和CPTⅠβ的表达及与骨骼肌脂质的相关性研究,观察罗格列酮干预对FAT/CD36和CPTⅠβ表达的影响。方法:动物分组及标本取得同第一部分。骨骼肌FAT/CD36mRNA表达采用实时荧光定量RT-PCR分析技术,CPTⅠβmRNA表达采用半定量RT-PCR分析技术,采用TRIZOL提取组织总RNA,鉴定RNA完整性,测定其在260nm和280nm的吸光度值(OD)。以完整性较好且OD260/OD280在1.8～2.0的RNA进行RT-PCR。Western-blot法分析FAT/CD36蛋白表达。结果:1与青年组比较,老年组骨骼肌FAT/CD36蛋白表达升高(P<0.05);与老年组相比,高脂组FAT/CD36蛋白表达明显升高,罗格列酮干预组FAT/CD36蛋白表达下降,差异有统计学意义(P<0.05)。2与青年组比较,老年对照组骨骼肌FAT/CD36mRNA表达升高(P<0.01);与老年组相比,高脂组FAT/CD36mRNA表达进一步明显升高,罗格列酮干预组FAT/CD36mRNA表达降低,差异均有统计学意义(P<0.01)。3老年组骨骼肌CPTⅠβmRNA表达与青年组比较差异无统计学意义(P>0.05);与老年组比较,高脂喂养组CPTⅠβmRNA表达下降;与高脂组比较,罗格列酮干预组CPTⅠβmRNA表达升高,差异有统计学意义(P<0.01)。4骨骼肌内长链酯酰辅酶A与FAT/CD36mRNA表达呈正相关,与CPTⅠβmRNA表达负相关(P<0.01)。结论:1与青年组相比,老年组大鼠骨骼肌细胞FAT/CD36mRNA和蛋白表达升高可能是老年组易发生脂质沉积的原因。2高脂饮食可使骨骼肌FAT/CD36mRNA和蛋白表达明显增加和CPTⅠβmRNA表达下降,可能导致饮食诱导骨骼肌内脂质沉积原因之一。3骨骼肌内长链酯酰辅酶A与FAT/CD36mRNA表达呈正相关,与CPTⅠβmRNA表达负相关,说明老年高脂大鼠骨骼肌脂质堆积与脂肪酸转运关键酶的表达异常有关。4罗格列酮干预使骨骼肌FAT/CD36mRNA和蛋白表达降低和CPTⅠβmRNA表达升高,可能相应减少骨骼肌脂质堆积,改善胰岛素抵抗。第三部分老年高脂饮食大鼠骨骼肌脂肪酸含量与PKB、GLUT4表达的相关性研究及罗格列酮干预影响目的:探讨老年和高脂环境因素对骨骼肌PKB和GLUT4mRNA和蛋白表达影响及罗格列酮干预的影响,并对骨骼肌内脂质与PKB和GLUT4表达的量进行了相关分析,以了解骨骼肌内脂质对胰岛素信号转导的影响。方法:动物分组及标本取得同第一部分。骨骼肌PKB和GLUT4mRNA表达采用实时荧光定量RT-PCR分析技术,PKB和GLUT4蛋白表达用Western-blot分析。结果:1与青年组相比,老年组PKBmRNA和蛋白表达降低;与老年组相比,高脂组PKBmRNA和蛋白表达进一步降低;罗格列酮干预组PKBmRNA和蛋白表达与高脂组相比明显升高,以上组间差异均有统计学意义(P<0.05)。2与青年组相比,老年组GLUT4mRNA和蛋白表达降低;与老年组相比,高脂组GLUT4mRNA和蛋白表达进一步降低;罗格列酮干预组GLUT4mRNA和蛋白表达与高脂组相比明显升高,以上组间差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。3 PKBmRNA表达的量与葡萄糖输注率正相关,GLUT4mRNA表达的量与葡萄糖输注率正相关,与骨骼肌LCACoA负相关(P均<0.01)。结论:1与青年组相比,老年组大鼠骨骼肌细胞PKBmRNA和蛋白表达下降, GLUT4mRNA和蛋白表达也下降,可能是老年组易出现胰岛素信号转导异常,胰岛素抵抗的发生增加。2高脂饮食可诱导PKBmRNA和蛋白表达及GLUT4mRNA和蛋白表达进一步下降,说明高脂环境因素可通过影响胰岛素信号转导的关键酶而促进胰岛素抵抗的形成。3相关分析表明,PKBmRNA表达的量与葡萄糖输注率明显正相关,GLUT4mRNA表达的量与骨骼肌内LCACoA负相关,和葡萄糖输注率正相关,说明骨骼肌内脂质通过影响胰岛素信号转导通路的关键酶参与胰岛素抵抗的形成。4罗格列酮干预可使高脂喂养老年大鼠骨骼肌PKBmRNA和蛋白表达及GLUT4mRNA和蛋白表达升高,可能是改善老年胰岛素抵抗的机制之一。第四部分高脂饮食和罗格列酮干预对老年大鼠脂肪和骨骼肌PPARγ表达的影响目的:通过观察高脂喂养老年大鼠脂肪和骨骼肌组织PPARγ的表达情况,探讨高脂饮食老年大鼠骨骼肌脂质代谢紊乱和罗格列酮改善胰岛素抵抗的机制。方法:动物分组及标本取得同第一部分。脂肪和骨骼肌组织PPARγmRNA表达采用实时荧光定量RT-PCR技术,脂肪和骨骼肌组织PPAR蛋白表达用Western-blot分析。结果:1与青年组相比,老年组脂肪组织PPARγmRNA和蛋白表达降低(P<0.05);与老年组相比,高脂组脂肪组织PPARγmRNA和蛋白表达明显降低(P<0.05);罗格列酮干预组脂肪组织PPARγmRNA和蛋白表达与高脂组相比明显升高,各组间差异均有统计学意义(P<0.01)。2与青年组相比,老年组骨骼肌组织PPARγmRNA和蛋白表达差异无显著性意义(P>0.05);与老年组相比,高脂组骨骼肌PPARγmRNA和蛋白表达明显降低(P<0.05或P<0.01);罗格列酮干预组骨骼肌PPARγmRNA和蛋白表达与高脂组相比明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:1与青年组相比,老年组大鼠脂肪组织PPARγmRNA和蛋白表达下降可能是老年脂肪酸代谢紊乱胰岛素抵抗发生增加原因之一。2高脂饮食可诱导老年大鼠脂肪组织和骨骼肌组织PPARγmRNA和蛋白表达下降,可能参与饮食诱导的骨骼肌脂肪酸代谢异常和胰岛素抵抗的形成。3罗格列酮干预可使高脂喂养老年大鼠骨骼肌和脂肪组织PPARγmRNA和蛋白表达升高,可能是改善老年胰岛素抵抗的机制之一。