背景和目的抑郁症（Depression）是一种常见的以情绪低落、快感缺乏、睡眠受阻、食欲不振、精力不足、自我价值感低、易产生自杀意念及认知功能出现障碍为特征的复杂性神经退行性疾病。Meta分析显示:近十年我国大学生抑郁症的患病率为31.38%,60岁以上老人患病率为25.55%,抑郁症在我国不同年龄组人群中仍有潜在增长趋势,是需要引起重视的一类疾病。世界卫生组织报导:目前全球抑郁症患者超过3.5亿人,表明抑郁症是全球重要的公共卫生问题。虽然现有的抑郁症治疗方法对患者有一定作用,但疗效不尽人意,大约33%的患者在使用抗抑郁药物后抑郁症状得到明显缓解,但仍有约30%的患者接受药物和心理方面的常规治疗后,并没有明显的效果。虽然有大量研究阐明抑郁症的病理生理学机制,但抑郁症的病因复杂多样,临床表现存在高度异质性,其发病的潜在分子机制仍不清楚。抑郁症的发病原因受遗传、社会环境、个体性格和心理活动等因素的影响,这些因素不仅导致脑部的代谢发生改变,而且使中枢多个部位结构和功能发生变化,同时还会影响整个机体的免疫调节。然而传统的抑郁症诊断分类不包含免疫失调与抑郁症的关系,因此探讨二者关系为研究抑郁症的产生机制提供了新方向。多项文献报道急性和慢性压力会使免疫系统失调引发炎症反应,进而促进抑郁症的发生和发展。最近研究显示:发生神经炎症时,一些炎症因子对蛋白的修饰有影响,如对微管相关蛋白-Tau蛋白具有调节作用。结合本课题组之前的研究结果“Tau蛋白过度磷酸化导致抑郁症的认知障碍”可知:神经炎症在神经退行性病变发病机制中具有极其重要的作用,值得进一步研究。文献表明:抑郁症时炎症因子增多、抗感染细胞因子减少、脑源性神经生长因子分泌减少,对神经细胞保护作用下降,引起大脑皮层和海马神经元丢失,导致海马功能降低,出现认知功能障碍等症状。本课题组之前的研究发现,DAPK1在小鼠前额叶皮层和海马的表达明显升高,使这些区域的Tau蛋白过度磷酸化,引起抑郁症的认知功能障碍。而对抑郁症时DAPK1如何升高的调控因素研究不清,需要进一步探索。用Animal TFBD数据库进行生物信息学分析发现:NF-κB可能是DAPK1潜在的上游转录因子。同时在Jaspar数据库进行查询发现:DAPK1基因的5’上游2000 bp内,存在9个潜在的NF-κB的结合位点,评分在10分以上的有两个,进一步证明:核因子-κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）可能是调控DAPK1表达的上游转录因子。NF-κB家族在先天免疫和特异性免疫中起关键作用,NF-κB通路的激活通常与炎症有关。NF-κB蛋白与NF-κB抑制蛋白IκB（inhibitor of NF-κB,IκB）一起存在于细胞质中,在一些诱导因子作用下被激活,IκB激酶即IKK复合物（inhibitor of kappa B kinase,IKK）活性升高使IκB蛋白发生磷酸化,之后被泛素化,进而被蛋白酶体降解。IκB的降解使NF-κB蛋白转移到细胞核内与同源的DNA位点结合,进而调控相关基因的转录。结合以上生物信息学分析,推测:DAPK1基因转录区域可能存在多个NF-κB的结合位点,而NF-κB的入核可以诱导DAPK1的基因表达,增加其蛋白的合成。本课题通过制备抑郁样小鼠模型（将C57BL/6J小鼠单笼单只饲养,模型制备过程中不定期进行慢性不可预测性温和刺激）,探讨抑郁样小鼠出现认知功能障碍时,炎症因子、NF-κB相关蛋白与DAPK1升高之间的关系。从而为抑郁症认知功能障碍的机制研究提供新的思路,为促进抑郁症治疗分子靶点的发现和改善抑郁症的治疗现状提供理论基础。方法1.制备抑郁模型选择体重在16-18 g范围内的一月龄雄性C56BL/6J小鼠,将小鼠分为两组:正常对照组和抑郁模型组。前者每笼4只,正常饲养;后者采用单笼单只饲养同时给予慢性不可预测性温和刺激的方式处理4个月。最后通过蔗糖偏爱实验初步判断小鼠是否出现抑郁症状。2.在模型组海马CA3区分别注射DAPK1和NF-κB的抑制剂两周后进行行为学检测将模型组小鼠分为4组,采用脑立体定位注射方法,将生理盐水或抑制剂定位注射至抑郁样小鼠海马CA3区。（1）注射生理盐水模型组（Depression）;（2）注射DAPK1抑制剂TC-DAPK 6组（DAPK1 inhibitor,DI）;（3）注射NF-κB抑制剂SN50组（SN50）;（4）注射两种抑制剂混合溶液TC-DAPK 6+SN50组（DI+SN50）。注射抑制剂两周后各组小鼠进行行为学检测:通过糖水偏好实验检测小鼠是否快感缺失;通过悬尾实验和强迫游泳实验检测小鼠的抑郁状态;通过Y迷宫和Morris水迷宫检测小鼠的空间工作记忆能力和空间学习记忆能力;通过社会交互实验检测小鼠的社会交往能力;通过高架十字迷宫和旷场实验检测小鼠的焦虑状况。3.行为学检测后麻醉处死动物,通过qPCR检测各组小鼠海马区DAPK1m RNA的表达变化行为学结束后,每组3只小鼠取新鲜海马组织,提取总RNA,按照反转录试剂盒将RNA反转录成c DNA。按照qPCR试剂盒检测小鼠海马组织的DAPK1m RNA表达情况。4.通过免疫组化,免疫荧光,HE染色,Western blot等技术检测各组小鼠海马区蛋白表达变化各组小鼠行为学检测结束后将小鼠麻醉,进行组织灌流后取脑或直接取新鲜海马组织进行分子生物学实验。通过Western blot检测海马炎症因子、NF-κB相关蛋白、DAPK1蛋白和Tau相关蛋白的表达变化;通过免疫组织化学染色检测炎症因子和NF-κB相关蛋白在细胞的分布和表达变化;通过免疫荧光观察NF-κB和DAPK1在海马中的表达定位及相互关系;通过HE染色检测各组小鼠神经元变化情况。结果1.通过蔗糖偏爱实验检测模型组小鼠出现抑郁样症状模型制备完成后进行蔗糖偏爱实验,与正常对照组相比,模型组蔗糖偏爱指数明显降低（P＜0.001）,显示模型组小鼠快感缺失,表现出抑郁现象,说明抑郁样小鼠造模成功。2.行为学检测结果显示:模型组小鼠与正常对照组相比有明显的抑郁现象,并出现认知障碍和社交障碍,抑制剂处理组小鼠症状均有缓解（1）与正常对照组相比,模型组小鼠蔗糖偏爱率降低（P＜0.001）,说明模型组小鼠快感缺失,表现出抑郁现象。DI、SN50和DI+SN50抑制剂组小鼠蔗糖消耗率较模型组升高（P＜0.001）,说明抑制剂可以改善小鼠的抑郁状态。（2）抑郁样小鼠与正常对照组相比在悬尾实验和强迫游泳实验中的不动时间变长（P＜0.001）,出现行为绝望现象,说明模型组小鼠出现明显抑郁样行为。抑制剂干预组的小鼠与抑郁样小鼠相比不动时间明显减少（P＜0.001）,说明抑制剂可以减轻抑郁样小鼠的行为绝望现象,改善小鼠的抑郁样行为。（3）抑郁样小鼠与正常对照组相比在Y迷宫检测中交替正确率降低（P＜0.001）,说明该组小鼠空间工作记忆能力降低,出现认知功能障碍。经抑制剂处理的抑郁样小鼠交替正确率明显升高（P＜0.001）,空间工作记忆能力被改善,说明抑制剂的处理可以减轻抑郁样小鼠的认知功能障碍。（4）在Morris水迷宫第5天检测时发现,与正常对照组相比,抑郁样小鼠的逃避潜伏期显著变长（P＜0.01）,第6天时穿越平台次数明显减少（P＜0.001）、在目标象限停留的时间明显变短（P＜0.001）,表明抑郁样小鼠空间学习记忆能力降低,出现认知障碍。抑制剂处理后,抑郁样小鼠前5天的逃避潜伏期与对照组变化趋势一致且没有显著差异,第6天抑制剂处理的小鼠与抑郁样小鼠相比穿越平台次数明显增多（P＜0.001）、在目标象限停留的时间明显变长（P＜0.001）。表明抑制剂组小鼠空间学习记忆能力降低的情况有所好转,认知功能障碍改善。（5）与正常对照组相比,抑郁样小鼠在社会交互实验中社会交互率明显变低（P＜0.001）,出现社交障碍。抑制剂干预的抑郁样小鼠社会交互率明显提高（P＜0.001）,社交能力恢复正常。说明抑制剂可以改善抑郁样小鼠的社交障碍。（6）高架十字迷宫和旷场实验中各组小鼠的开臂活动时间百分比和中心区域活动时间百分比皆无差异（P＞0.05）,表明各组小鼠均没有出现焦虑现象。3.抑制剂处理后检测各组小鼠海马区DAPK1 m RNA的表达显示:抑郁样小鼠表达增多,各抑制剂组表达减少与正常对照组相比,抑郁样小鼠DAPK1 m RNA的表达增多（P＜0.001）,抑制剂组的DAPK1 m RNA表达与抑郁样小鼠相比明显降低（P＜0.01;P＜0.001）,表明NF-κB p65在基因水平影响DAPK1的表达。4.分子生物学实验结果显示:抑郁样小鼠海马DAPK1和NF-κB相关蛋白表达升高;DI组DAPK1的表达降低,但对NF-κB相关蛋白的表达无影响;SN50组和DI+SN50组,DAPK1和NF-κB相关蛋白表达均降低（1）与正常对照组相比,抑郁样小鼠炎症因子TNF-α和IL-1β的表达增多（P＜0.001）,DI组的TNF-α和IL-1β表达与抑郁组相比无明显变化,而SN50组和DI+SN50组的TNF-α和IL-1β的表达减少（P＜0.01,P＜0.001）。证明DAPK1不调节TNF-α和IL-1β的表达,而NF-κB可以影响TNF-α和IL-1β的表达。（2）抑郁样小鼠海马区TNF-α和IL-1β增多,TNF-α和IL-1β是公认的NF-κB通路的激活因子,因此检测了NF-κB通路的相关蛋白。与正常对照组相比抑郁样小鼠海马组织中p-IKK、p-IκBα、p-p65表达增多（P＜0.001,P＜0.01,P＜0.05）,证明IKK、IκBα、p65活化程度升高,炎症因子的过量表达使NF-κB通路中的IKK、IκBα、NF-κB p65活性升高。DI组各蛋白表达情况与对照组相比仍明显增多（P＜0.001,P＜0.01,P＜0.01）,SN50组和DI+SN50组的p-IKK、p-IκBα、p-p65表达较抑郁组减少（P＜0.001,P＜0.01,P＜0.05）。说明DAPK1对NF-κB通路相关因子无影响,而NF-κB抑制剂可以有效抑制NF-κB通路的激活。（3）与正常对照组相比模型组DAPK1表达增多（P＜0.001）、p-DAPK1表达减少（P＜0.001）,证明抑郁后DAPK1的表达增多、活性增强。经抑制剂干预后,较抑郁组DAPK1表达减少（P＜0.001）、p-DAPK1表达增多（P＜0.001）,证明TC-DAPK 6和SN50都可以有效抑制DAPK1的表达和活性,所以DAPK1的表达和活性受NF-κB相关蛋白的影响。（4）本实验室前期研究发现,抑郁样小鼠DAPK1表达增多会使Tau蛋白的磷酸化程度增高,本课题检测磷酸化的Tau蛋白进行验证。结果发现,抑郁后磷酸化Tau蛋白表达量增多,抑制剂干预可以降低抑郁样小鼠磷酸化Tau蛋白的表达量。结果证实了Tau蛋白的磷酸化程度受DAPK1的调控。（5）免疫组化结果显示:与对照组相比,模型组和DI组的TNF-α、IL-1β和p-p65表达增多且p-p65出现核转移,SN50和DI+SN50组上述分子表达减少。与对照组相比,模型组DAPK1表达增多,DI组、SN50组和DI+SN50组DAPK1表达较抑郁组减少。（6）免疫荧光实验结果显示:与对照组相比,抑郁样小鼠海马CA3区pp65和DAPK1表达都增多,DI组DAPK1的表达减少、p-p65的表达与模型组相比无明显变化,SN50组和DI+SN50组小鼠的DAPK1和p-p65表达都比抑郁样小鼠少。结果说明:降低DAPK1的表达量对NF-κB相关蛋白的表达没有影响,而降低NF-κB p65的活化程度之后,DAPK1表达减少,表明DAPK1受NF-κB的调控。（7）HE染色结果显示:与对照组相比,抑郁样小鼠前额叶皮层、CA3区、CA1区和DG区的神经元数目减少。DI、SN50和DI+SN50组相应部位神经元数目较抑郁组增多。结论1.孤养加慢性不可预测性温和刺激是制备抑郁样小鼠模型的有效方式,小鼠的抑郁症状与脑内炎症因子升高有关。2.在抑郁症中炎症因子的表达增多,激活NF-κB,NF-κB p65被活化为pp65并转移到细胞核内启动DAPK1的转录,使DAPK1蛋白表达增多,引起Tau蛋白过度磷酸化,最终导致抑郁症出现认知功能障碍。