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大肠杆菌是寄居在哺乳动物和禽类肠道中正常菌群之一,这一物种由非致病性菌株和具有不同致病潜能的致病菌株组成。少数致病性菌株,可引起机体肠道感染和肠道外感染两大类疾病。致肠道外感染的大肠杆菌,如尿道致病性大肠杆菌(Uropathogenic E.coli, UPEC),新生儿脑膜炎大肠杆菌(Neonatal meningitis-associated E.coli, NMEC)和败血症大肠杆菌(Sepsis-causing E.coli, SEPEC)己被Johnson和Russo归为一种新型致病性大肠杆菌—肠道外致病性大肠杆菌(Extraintestinal pathogenic E.coli, ExPEC)。另外,引起家禽局部或全身性感染的禽病原性大肠杆菌(Avian pathogenic E.coli, APEC)与引起人类感染的ExPEC (NMEC和UPEC)具有某些相似的致病因子,如1型菌毛、P菌毛、荚膜、铁摄取系统、侵袭素IbeA等。有假设认为禽可能是UPEC的主要携带者,或者APEC可能是UPEC毒力基因的贮库。本研究主要通过探讨荚膜、铁摄取系统、转录调控蛋白RfaH对APEC和UPEC致病性的影响,比较两者毒力因子和致病机理的相似性,从而加深我们对APEC. UPEC毒力基因的形成、演化、致病机制的理解,强化我们对APEC作为UPEC毒力基因贮库这一推断的认识,为深入研究尿道感染(Urinary tract infections, UTIs)和禽大肠杆菌病的致病机理和特异防制措施奠定基础。1.铁摄取系统对肠道外致病性大肠杆菌毒力的影响APEC和UPEC都含有多种铁摄取系统,包括血红素和铁结合性复合物。本研究以血红素、沙门菌素和气杆菌素三种铁摄取系统为研究对象,分别选取其摄铁相关基因chuT、 iroD、iucD,运用λRed重组系统构建APEC E058和UPEC U17基因缺失株,进行了多项体外及体内试验,评价其致病性,旨在探究铁摄取系统与APEC和UPEC致病性之间的关系,并比较两者毒力因子之间的相似性,为深入研究APEC和UPEC的致病机理和特异性防制措施奠定基础。研究结果显示,在SPF鸡感染模型中,沙门菌素缺失株E058ΔiroD和U17ΔiroD与野生株相比,致病力显著下降,气杆菌素缺失株E058ΔiucD和U17ΔiucD在部分脏器中定植能力下降,而血红素缺失株E058ΔchuT和U17ΔchuT未见致弱。三基因缺失株E058ΔchuTΔiroDΔiucD和U17ΔchuTΔiroDΔiucD致弱程度最为显著。组织病理学结果显示,野生株感染鸡的脏器病变程度较ΔiroD, ΔiucD及三基因缺失株感染情况更为严重,而ΔchuT缺失株感染鸡的脏器病变程度与野生株相似。但是,体外试验结果显示,突变株与野生株在抗血清补体杀菌、HD-11细胞吞噬和胞内增殖,及在富铁或缺铁培养基中生长情况等方面都没有显著差异。SPF鸡致病试验表明介导沙门菌素摄铁的iroD基因和编码气杆菌素合成的iucD基因与APEC和UPEC致病性有较强的相关性,而介导血红素摄铁基因chuT对其致病性影响不大。APEC和UPEC具有相似的摄铁机制和致病能力,同时还可以看出沙门菌素铁结合性复合物在鸡体内摄铁方面起着更为重要的作用,但这些摄铁系统之间的关系是相互独立还是存在依赖关系还不清楚,有待于进一步研究。2.调控蛋白RfaH调控相关基因表达情况及对肠道外致病性大肠杆菌毒力的影响RfaH在大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌中是一种重要的调控蛋白,能够增强某些细菌相关毒力因子的表达,如荚膜、脂多糖、溶血素、铁摄取系统等。它对于APEC毒力的直接影响至今还未见报道。本研究发现rfaH基因的缺失能显著降低APEC E058和UPEC U17的致病力。1日龄雏鸡致病性试验结果显示rfaH基因突变株E058ΔrfaH和U17ΔrfaH对鸡失去致病力,35日龄SPF鸡体内动态分布和竞争试验显示ArfaH突变株在鸡体内定殖能力显著下降；血清杀菌学试验表明突变株抗血清补体杀菌能力显著下降；鸡巨噬细胞HD-11吞噬和细菌胞内定殖试验结果显示,突变株抗吞噬和胞内生存能力明显致弱。对突变株进行rfaH基因回复能够使其恢复到野生株的毒力水平。同时,荧光定量PCR试验结果显示rfaH基因缺失能显著降低荚膜转运相关基因kpsM和kpsE、血红素受体基因chuA、抗血清补体相关基因traT和iss,及肠菌素ColicinV合成基因cvaC的表达量。上述结果表明,RfaH是肠道外致病性大肠杆菌的一种重要的毒力因子,对其致病性起着关键的作用。3.肠道外致病性大肠杆菌荚膜缺失株的构建及其致病性研究荚膜在大肠杆菌抗血清补体和细胞吞噬方面发挥着重要的作用,利用λRed重组系统分别构建APEC E058和UPEC U17荚膜转运基因kpsED双基因缺失株E058ΔkpsED和U17ΔkpsED,并成功将抗性基因去除,研究其生物学特性,为弱毒疫苗的开发提供条件。生物学试验结果显示,kpsED双基因缺失株的生长速度较野生株没有明显差异,但缺失株抗血清补体杀菌能力和抗鸡巨噬细胞HD-11细胞吞噬能力显著下降。kpsED双基因的缺失能显著降低APEC E058和UPEC U17的致病力。1日龄雏鸡LD50致病性试验结果显示,突变株E058ΔkpsED和U17ΔkpsED对鸡失去致病力,35日龄SPF鸡体内动态分布和竞争试验显示ΔkpsED突变株在鸡体内定殖能力和竞争性生长能力显著下降,提示其有可能作为弱毒疫苗候选菌株。