【摘 要】
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目的:探究4NQO药物诱导C57BL/6小鼠PLCE1不同基因型食管癌变的微观及超微结构形态特征、及增殖、自噬和代谢相关指标的变化,以及初步探究PLCE1抑制剂U73122在抑制食管癌的进展中的作用机制。方法:（1）CRISPR/Cas9技术构建PLCE1-/-C57BL/6小鼠,雌雄PLCE1+/-C57BL/6小鼠合笼繁殖子代小鼠,鉴定基因型。（2）选取成年健康小鼠按照PLCE1三种基因型将其
【基金项目】
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国家自然科学基金（No.U1903305,81760436,81773116和81860518）； 新疆生产建设兵团中青年科技领军人才项目（No.2019CB022）； 石河子大学国际科技合作项目（No.GJHZ201702）；
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目的:探究4NQO药物诱导C57BL/6小鼠PLCE1不同基因型食管癌变的微观及超微结构形态特征、及增殖、自噬和代谢相关指标的变化,以及初步探究PLCE1抑制剂U73122在抑制食管癌的进展中的作用机制。方法:（1）CRISPR/Cas9技术构建PLCE1-/-C57BL/6小鼠,雌雄PLCE1+/-C57BL/6小鼠合笼繁殖子代小鼠,鉴定基因型。（2）选取成年健康小鼠按照PLCE1三种基因型将其随机分为三组。使用100μg/ml4NQO溶液及丙二醇溶液建立实验组与对照组动物模型,光学显微镜及透射电镜下观察食管上皮形态特点。（3）免疫组织化学染色法评价PLCE1、增殖蛋白P16、Ki-67及MCM家族蛋白,自噬蛋白Beclin1、LC3,糖酵解关键酶ENO1、PKM2、LDHA在实验组和对照组小鼠食管组织中的表达水平差异。同时基于GEO数据库中（GESA20347）芯片数据、UALCAN及TIMER2.0在线数据库分析人食管癌与食管正常组织样本中以上蛋白的表达水平差异。（5）模型建立后使用PLCE1抑制剂U73122和其模拟物U73343隔日腹腔注射3只U73122实验组及U73343阳性对照组PLCE1+/+C57BL/6小鼠,4周后观察两组小鼠一般精神状态和体重变化,HE及免疫组化染色评估小鼠食管组织病变特点及PLCE1、P16、Ki-67、MCM家族蛋白、Beclin1、LC3、ENO1的表达水平变化。结果:（1）三组实验小鼠体重无差异,精神状态均良好。（2）大体观三种基因型小鼠食管粘膜肿瘤数量显示,PLCE1+/+C57BL/6小鼠食管组织肿瘤数量多于PLCE1-/-C57BL/6小鼠,差异具有统计学意义（P<0.05）。对数字切片进行镜下肿瘤数量、大小评估,显示PLCE1+/+C57BL/6小鼠食管粘膜上皮肿瘤数量最多,其次是PLCE1+/-C57BL/6小鼠,最少的是PLCE1-/-C57BL/6小鼠,两两比较均具有统计学差异（P<0.05）。PLCE1+/+C57BL/6小鼠食管粘膜上皮平均肿瘤体积最大,最小者为PLCE1-/-C57BL/6小鼠,二者差异具有统计学意义（P<0.05）。实验组PLCE1+/+C57BL/6小鼠生存期明显短于PLCE1-/-C57BL/6小鼠,且差异具有统计学意义（P<0.05）,实验组PLCE1+/-C57BL/6小鼠的生存期短于PLCE1-/-C57BL/6小鼠,且差异具有统计学意义（P<0.05）。透射电镜观察显示,实验组PLCE1+/+C57BL/6小鼠食管组织与对照组C57BL/6小鼠相比,细胞之间的缝隙增宽,桥粒连接数量减少,细胞质水肿并可见空泡,线粒体数目减少,线粒体空泡及嵴和膜的融合消失,细胞异型性明显,染色质变异明显,可见多量异型核。（3）免疫组织化学染色显示PLCE1,P16、Ki-67及MCM家族蛋白MCM2、MCM3、MCM5、MCM6、MCM7在实验组PLCE1+/+C57BL/6小鼠食管癌组织中的表达明显高于实验组及对照组PLCE1-/-C57BL/6小鼠食管组织,Beclin1、LC3在实验组PLCE1+/+C57BL/6小鼠食管癌组织中的表达明显低于实验组及对照组PLCE1-/-C57BL/6小鼠食管组织。同时,生物信息学分析显示,食管癌与正常组织中P16、Ki-67、MCM家族蛋白及Beclin1、LC3B的表达与小鼠食管组织中表达趋势一致（P<0.05）。（4）糖酵解关键酶ENO1、PKM2、LDHA在实验组PLCE1+/+C57BL/6小鼠食管癌组织中的表达明显高于实验组及对照组PLCE1-/-C57BL/6小鼠食管组织,生物信息学分析人食管癌组织中ENO1、PKM2、LDHA的表达高于正常组织（P<0.05）。（5）U73122实验组小鼠精神状态较之前有所改善,行为、活动能力增强,体重稍有增加,大体观察食管粘膜肿瘤范围减小,显微镜下观察到食管上皮病变有减轻,肿瘤的范围适当缩小,对照组小鼠精神状态逐渐变差,体重逐渐下降。免疫组化显示,U73122组PLCE1、P16、Ki-67、MCM家族蛋白及ENO1和的表达均明显低于U73343阳性对照组,Beclin1、LC3的表达均明显高于U73343阳性对照组。结论:（1）在食管鳞癌中,PLCE1可能通过调控P16、Ki-67,Beclin1、LC3,及MCM家族分子MCM2、MCM3、MCM5、MCM6、MCM7的表达,进而影响肿瘤细胞的增殖、自噬水平。（2）PLCE1可能通过调节ENO1影响糖酵解途径进而影响食管鳞癌发生发展。（3）PLCE1抑制剂U73122可能减缓小鼠食管上皮病变发展并延长食管鳞癌小鼠生存期。
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