论文部分内容阅读
狂犬病是一种古老的而又持续流行至今的自然疫源性疾病。由于其发病后100%的致死率,狂犬病在全球范围内每年会夺走近5.5万人的生命。中国是发病例数仅次于印度的狂犬病肆虐区,正在经历新中国成立以来的第三次狂犬病大流行,年均约2000～3000患者因此而丧生。作为一种负链RNA病毒,狂犬病毒遗传变异很快。国际病毒分类学委员会(ICTV)于2012年将全球的狂犬病毒属分为RABV、LBV、MOKV、DUVV、EBLV-1、 EBLV-2、ABLV、ARAV、KHUV、IRKV、WCBV和HIBV共12个基因型,我国目前主要流行的为RABV狂犬病毒。G蛋白是狂犬病毒的主要毒力决定因素。研究发现狂犬病毒弱毒株与街毒株致病性不同的主要原因之一是G蛋白的表达水平不同。鉴于此,本研究针对2008年分离自中国安徽犬脑的一株狂犬病毒街毒株DRV-AH08进行基因组序列测定及系统进化分析,进一步研究该毒株与弱毒株ERA株G蛋白表达量、免疫原性和重组疫苗对小鼠的免疫效果的差异。主要研究内容如下：1狂犬病毒街毒株DRV-AH08的分类鉴定及全基因组序列测定RT-nest PCR扩增结果表明,DRV-AH08属RABV狂犬病毒。据此,设计了10对引物完成了基因组序列的扩增及拼接,DRV-AH08GeneBank号：HQ450385。2DRV-AH08基因组结构及系统进化分析DRV-AH08株基因组全长11924个核苷酸(nt),基因组编码基因如下:N1353nt, P891nt, M609nt, G1575nt和L6384nt。DRV-AH08全基因组系统进化分析结果表明：世界范围内基因Ⅰ型狂犬病毒属可分为clade Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3个进化分支,DRV-AH08属于clade Ⅰ。推导的G氨基酸序列分析表明：clade Ⅰ和Ⅱ狂犬病毒起源于共同的祖先clade Ⅲ,且cladell与clade Ⅲ的亲缘关系Ⅰ更近。分子钟分析结果证实：clade Ⅰ和Ⅱ狂犬病毒约于939～1536年前由clade Ⅲ分化而来,而clade Ⅰ和Ⅱ约于195～670年前开始进化成不同的分支。3地域环境产生的选择压力会影响病毒进化不同地域环境下的两个优势毒株(DRV-AH08, China Ⅰ,当前流行于中国；DRV-Mexico, D11,流行于墨西哥)氨基酸比对结果发现其N、G和L蛋白共存在17个氨基酸位点变异。推测这些变异与病毒的复制和毒力关联很大,如当前中国狂犬病流行趋势中病程缩短等。4不同毒力毒株G蛋白表达差异研究本研究以杆状病毒为载体,构建了表达弱毒株ERA和街毒株DRV-AH08G蛋白的8个重组杆状病毒。细胞转导实验表明：弱毒株G蛋白在昆虫和哺乳动物细胞(BHK中的表达量均高于街毒株；且弱毒株G蛋白生物学活性更好,在重组杆状病毒上携带量更多。5DRV-AH08和ERA株G蛋白免疫原性研究首先,我们以等量(1×108PFU)重组杆状病毒免疫小鼠,一免、二免后表达弱毒株G蛋白的疫苗免疫组小鼠体内NA水平更高；攻毒后体重变化更少,临床症状更轻,存活率也更高：BAC-E1-E2(100%)>BAC-E1-S2(90%)>BAC-S1-E2(80%)>BAC-S1-S2(66.7%)>BAC-E1(60%)>BAC-E2(40%)>BAC-S2(10%)> B AC-S1(0%)。继而,我们以携带等量G蛋白的重组杆状病毒BAC-E1(1×108PFU)和BAC-S1(2×108PFU)免疫小鼠,结果发现,B AC-S1免疫组小鼠仍无(一免后)或者仅有很低的NA(二免后)产生,无法对小鼠产生有效保护(保护率0%)。该结果进一步证实：弱毒株G蛋白的免疫原性显著优于街毒株G蛋白。同时,表达2个拷贝G基因的重组疫苗BAC-E1-E2能显著提高疫苗的免疫效力,在低免疫剂量下即可对小鼠达到100%的免疫保护,可用于狂犬病的预防和控制。该策略也提示我们今后狂犬病疫苗的研发：可通过同时插入多个免疫原性好的基因及趋化因子等进行共表达,以更好激发机体先天免疫及诱导特异性免疫,进而达到更理想的保护效果。