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肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤,每年导致的死亡人数在所有癌肿里排第一位。肺癌包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌。非小细胞肺癌约占所有肺癌的80%,主要包括腺癌、鳞癌和大细胞癌。肺癌的病因至今不完全明确,其危险因素主要包括吸烟、感染、大气污染、家族遗传因素等。肺腺癌约占全部肺癌的一半。近几十年来,对肺腺癌的治疗作出了巨大努力,尤其是在靶向药物和免疫治疗药物的研发与应用方面。然而,肺腺癌的整体生存率仍然较差。探索肺腺癌相关分子机制有利于鉴定新的潜在的分子治疗靶点。微小RNA(miRNAs)是一种含有22-25个核苷酸的小型非编码RNA,通过直接与其靶基因的3’-非翻译区(3’-UTRs)相互作用,从而导致mRNA降解或翻译抑制。因此,miRNAs可以通过调控大量基因的表达,参与各种生物过程的调节,包括细胞增殖、分化、凋亡、细胞周期、迁移等。此外,通过调控癌基因或抑癌基因的表达,许多miRNAs在包括肺腺癌在内的恶性肿瘤的发生和发展过程中发挥重要作用。因此,探索miRNAs在肺腺癌中的表达和功能有助于鉴定新型生物标志物和治疗靶标。最近研究发现miR-148a在多种恶性肿瘤中异常表达,发挥肿瘤抑制或促进作用。例如,miR-148a在胃癌组织和细胞系中表达显著下调,并且通过灭活STAT3和Akt靶向CCK-BR而在胃癌发生中起抑制作用。非小细胞肺癌血清中miR-148a的表达显著低于良性肺病组和健康对照组。多项研究结果显示,miR-148a在非小细胞肺癌中起抑制作用。然而,miR-148a在肺腺癌生长中的调控机制仍不太清楚。本研究旨在探讨miR-148a在肺腺癌中表达的临床意义,并探讨其在肺腺癌生长中的作用和调控机制。方法1.在2011年6月至2013年10月期间,从53例肺腺癌患者中收集肺腺癌组织和癌旁非肿瘤组织,抽提RNA,RT-PCR检测miR-148a的表达水平。2.将53例肺腺癌患者分成miR-148a高表达组和低表达组,研究miR-148a表达与肺腺癌患者年龄、性别、肿瘤大小、吸烟史、肿瘤分化、临床分期、转移以及预后生存时间的相关性。3.传代培养肺腺癌细胞系(H23,H1975,H2228和H2085)和正常支气管上皮细胞系BEAS-2B。抽提RNA,RT-PCR检测miR-148a的表达水平。4.向H23和H1975肺腺癌细胞中转染miR-148a模拟物,转染48小时后,RT-PCR检测miR-148a的表达,CCK-8实验检测细胞增殖,克隆形成实验检测成克隆能力,流式细胞检测细胞周期分布。5.利用生物信息学和双荧光素酶报告基因检测,验证miR-148a和E2F3的靶点关系。6.探索在肺腺癌细胞中miR-148a对E2F3的调控作用。7.RT-PCR检测E2F3在53对肺腺癌组织和癌旁非肿瘤组织中的表达水平,以及在肺腺癌细胞系(H23,H1975,H2228和H2085)和正常支气管上皮细胞系BEAS-2B中的表达水平。研究E2F3和miR-148a在53例肺腺癌组织中的表达相关性。8.向H23和H1975肺腺癌细胞中共转染miR-148a模拟物和E2F3表达质粒,转染48小时后,RT-PCR和Western Blot检测E2F3的表达水平,CCK-8实验检测细胞增殖,克隆形成实验检测成克隆能力,流式细胞检测细胞周期分布。结果1.选取53例肺腺癌患者,手术获得肺腺癌组织及癌旁组织,利用RT-PCR检测组织样本中miR-148a的表达水平。结果表明,肺腺癌组织中miR-148a的表达水平显著低于癌旁组织。2.选取4种肺腺癌细胞系(H23,H1975,H2228和H2085)和1株正常支气管上皮细胞系(BEAS-2B),利用RT-PCR检测各细胞系中miR-148a的表达水平。结果表明,肺腺癌细胞中miR-148a的表达水平显著低于正常支气管上皮细胞系。3.利用卡方检验研究肺腺癌患者miR-148a表达与临床病理学特征之间的关联。结果显示,低miR-148a表达与高TNM分期和淋巴结转移显著相关。4.与miR-148a高表达的肺腺癌患者相比,miR-148a低表达的肺腺癌患者具有更短的存活时间。5.将miR-148a模拟物转染到肺腺癌细胞系H23和H1975细胞。转染48小时后,进行RT-qPCR检测。结果显示,与对照组相比,在miR-148a组中miR-148a的表达水平显著上调。6.与对照组相比,转染miR-148a模拟物组肺腺癌细胞的增殖水平显著下降,克隆形成能力减弱,细胞周期显著阻滞于G1期。7.生物信息学和双荧光素酶报告基因检测结果表明miR-148a和E2F3存在靶点关系。8.向肺腺癌细胞系H23和H1975细胞共转染miR-148a模拟物和E2F3表达质粒。对照组则共转染miR-148a模拟物和空白质粒。与对照组相比,实验组中E2F3 mRNA和蛋白的表达水平显著升高。9.选取53例肺腺癌患者,手术获得肺腺癌组织及癌旁组织,利用RT-PCR检测组织样本中E2F3的表达水平。结果表明,肺腺癌组织中E2F3的表达水平显著高于癌旁组织。10.向肺腺癌细胞系H23和H1975细胞共转染miR-148a模拟物和E2F3表达质粒。对照组则共转染miR-148a模拟物和空白质粒。与对照组相比,实验组细胞增殖、克隆形成显著上调,细胞周期进展加快。结论1.miR-148a在肺腺癌中的表达水平显著降低,且与肺腺癌恶性程度及不良预后密切相关。2.上调miR-148a能显著抑制肺腺癌细胞系的增殖和克隆形成能力,其原因可能是由于导致了细胞周期阻滞于G1期。3.E2F3是miR-148a的靶基因,在肺腺癌细胞系中,miR-148a能负调控E2F3的表达。4.E2F3在肺腺癌中的表达显著升高,在肺腺癌组织中,miR-148a与E2F3的表达水平显著负相关,提示E2F3的表达升高可能是miR-148a表达降低导致的。5.E2F3很可能作为miR-148a的下游靶基因,参与了 miR-148a对肺腺癌细胞增殖的调控作用。