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工业上木薯乙醇发酵普遍存在工序复杂、耗能大等问题。本研究通过基因工程技术，构建能同时高水平分泌表达α-淀粉酶与糖化酶的重组酿酒酵母菌株，并利用此重组工程菌株，进行了木薯乙醇直接发酵的工艺研究。首先提取米曲霉CICC40344和黑曲霉CICC40179的总RNA并反转录制备cDNA。参照NCBI公布的基因序列设计引物，扩增出α-淀粉酶基因amy与糖化酶基因ga。将其依次连入真核多基因表达载体pScIKP得到重组质粒pSc-ga-amy，通过电击转化重组进工业多倍体酿酒酵母AS2.489的基因组。用碘-淀粉水解圈与SDS-PAGE方法筛选出能够同时表达分泌两种酶的重组菌株，测定其α-淀粉酶与糖化酶活性分别为0.865U/ml与34.79U/ml，即酶活组成比例约为1：40。设计酶活配比试验，研究两淀粉酶协同作用，发现当α-淀粉酶与糖化酶酶活份数比例为1：5（当α-淀粉酶与糖化酶分别为1U与40U时，即份数比例为1：1）时，其水解淀粉的效果最好。利用Nhe I与Xba I同尾酶酶切位点向pScIKP载体中多次插入首尾相连的糖化酶基因表达盒，使载体上amy与ga表达盒比例为1：5，以此调节两种淀粉酶蛋白表达量比例，进而提高重组菌株的淀粉水解能力。但是构建好1个α-淀粉酶与5个糖化酶基因串联表达的重组酵母后发现，其水解淀粉的能力并未随之增强，分析原因可能与各基因启动子的相互干扰、整合随机性、rDNA功能受到破坏、位置效应、翻译极性等因素有关。从已构建的重组酵母菌株中筛选出淀粉水解能力最强菌株AS2.489/pScAG，对其生长特性、酶学性质及遗传稳定性进行研究，并通过正交试验对直接淀粉发酵条件进行优化。利用工程酵母AS2.489/pScAG于5L发酵罐中对200g/l的木薯粉进行直接发酵，4d内发酵液中乙醇体积分数达到8.68%，约为理论值的80.9%。该结果表明，获得的重组酵母发酵性能优越，在无需预处理、不添加任何商业酶的条件下对木薯的直接发酵效果良好，能够大大简化生产工艺与节能降耗、节约成本，具有重要的生产应用价值。