水貂圆环病毒Cap基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

来源 :吉林农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:bj_mark001
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
水貂圆环病毒病是在我国发现的一种由水貂圆环病毒(Mink Circovirus , MiCV)感染引起的,以水貂腹泻为主要特征的病毒病。我国的水貂圆环病毒病最早于1978年在大连被发现,该病现已遍布我国水貂主要养殖区。水貂圆环病毒发现于2013年,迄今为止,水貂圆环病毒的致病机制尚不清楚,有效预防该病的疫苗尚未研制成功,在防治方面也无良好的办法,该病的防控已成为水貂养殖领域的难题。
  为了解MiCV的遗传变异及流行情况,对实验室分离的MiCVHB3株进行全基因序列测定,结果表明,HB3株基因组全长1753bp(GenBank登录号为MK561562),与参考MiCV毒株全基因序列同源性为98.9%~99.7%,Rep和Cap基因的同源性分别为99.3%~99.9%和99.6%~100%。该毒株的遗传进化分析结果表明,HB3株与MiCV参考毒株亲缘关系较近,位于同一分支,而与PCV2、GoCV、DogCV1698和BtCVXOR亲缘关系较远,位于不同分支。同时对采集自辽宁省大连市和吉林省吉林市的239份临床样品进行MiCV的PCR检测,结果采集自大连的102份样品中PCR检测阳性数为54份,阳性检出率为52.9%;采集自吉林市的137份样品中PCR检测阳性样品数为79份,阳性检出率为57.7%,结果表明MiCV在大连市和吉林市感染阳性率较高。
  应用生物软件分析实验室分离的MiCV流行毒株HB3株的Cap全长基因684bp,设计特异性引物,对其进行PCR扩增。将PCR扩增产物与原核表达载体pET-28a连接,获得重组表达质粒pET-28a-Cap,将其转入感受态细胞BL21(DE3),通过对IPTG诱导条件的优化,确定最佳条件为37℃诱导4h,IPTG终浓度为1mmol/L时蛋白表达效果最好,在大约33KD处获得特异性蛋白条带。对重组表达蛋白进行纯化,得到Cap纯化蛋白,WesternBlot检测结果表明,Cap蛋白能够与MiCV阳性血清发生特异性反应。
  以纯化的重组Cap蛋白为包被抗原,建立了MiCV抗体检测的间接ELISA检测方法:重组蛋白作为包被抗原浓度为4.0μg/mL,4℃包被过夜;封闭液为含3%BSA的PBST;一抗血清的稀释度为1∶160,37℃孵育60min;兔抗貂酶标二抗37℃孵育60min;显色条件为37℃、20min。确定的临界值为0.347,即当样品OD450nm值大于0.347时,结果判定为阳性;样品OD450nm值小于0.347时,结果判定为阴性。该方法具有较好的特异性、敏感性和重复性。应用该方法对大连市和吉林市采集的血清样品进行检测,与PCR检测方法的符合率为90.79%。表明建立的用于检测MiCV抗体的间接ELISA方法结果可靠,可用于临床样品的检测。
其他文献
背景:生物钟基因Per2在包括口腔鳞癌的多种癌症中表达异常,并能通过调控细胞增殖和凋亡的改变促进癌症的发生发展。然而,Per2在口腔鳞癌中的调控机制尚不清楚。  目的:本研究从体内外探究生物钟基因Per2在口腔鳞癌中的表达、机制和功能。  方法:用RT-PCR和westernblotting检测正常口腔上皮细胞HOMEC和三株口腔鳞癌细胞株(CAL27、SCC15和TSCCA)中Per2的表达水平
学位
期刊
期刊
期刊
期刊
粪肠球菌为革兰氏阳性菌,普遍存在于环境中,近年来已经成为医院获得性感染的主要原因之一,可引起人的心内膜炎、菌血症、泌尿道感染及脑膜炎等疾病。随着抗生素的过度使用,由耐万古霉素肠球菌引起的医院感染已成为主要问题。噬菌体是感染细菌的病毒,在自然界中无处不在。裂解酶是由噬菌体自身编码的酶,在裂解周期结束时通过降解细胞壁肽聚糖释放子代噬菌体。二者在治疗耐药菌感染方面都具有极大的应用潜力。  本研究以临床分
学位
试验一乳酸菌发酵饲料对蛋鸡免疫功能影响及PI3K/Akt信号通路研究  试验旨在研究乳酸菌发酵饲料对蛋鸡免疫功能和PI3K/Akt信号通路的影响。选取60羽14日龄SPF蛋雏鸡,随机分为4组,每组5个重复,每个重复3羽。1组为基础饲料组,2组为乳酸菌发酵饲料组,3组为基础饲料加PI3K阻断剂组,4组为乳酸菌发酵饲料加PI3K阻断剂组,试验21d。结果表明,乳酸菌发酵饲料显著降低料肉比(P<0.05
奶牛乳房炎的发病率高,损害严重,难以治疗.研究HSP72和IRAK-M对奶牛乳腺上皮细胞TLR4信号转导机制的抑制作用,可以进一步揭示乳腺炎的分子调控网络,为筛选抗乳腺炎分子药物提供新的理论依据.将培养的乳腺上皮细胞随机分为4组:对照组,LPS组,HSP72组和HSP72+LPS组.用免疫组织化学染色法、实时荧光定量PCR法和Westernblot法鉴定奶牛乳腺上皮细胞内相关因子蛋白和mRNA相对
热应激能够阻碍体内、外哺乳动物早期的胚胎发育,抑制小鼠胚胎的发育能力。小鼠附植前胚胎对热应激最敏感。在热应激条件下,哺乳动物体内细胞的ERK1/2(细胞外信号调节激酶1和2)信号通路会通过Ras/Raf/MEK1/MEK2途径被激活/抑制,从而调节细胞生长和存活。受热应激时,细胞会发生过度凋亡,而线粒体诱导的凋亡通路发挥重要作用。目前,附植前胚胎受热应激后ERK1/2信号通路是否起作用、其机制如何
学位
目的:本试验通过对山东省14个地区的奶牛奶样进行主要病原菌调查,了解山东地区奶牛奶样菌株流行情况,为后期奶牛疾病防控提供依据;了解不同地区、不同菌株和不同样品间的耐药性差异,为养殖场临床用药提供指导;结合多位点序列分型(MLST)方法对不同菌株进行分子分型研究,比较菌株间的亲缘关系和耐药性关系,为菌株的流行病学研究提供技术支持。  方法:2017年6月--2018年7月,采集山东省14个地级市的1
学位