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水貂圆环病毒病是在我国发现的一种由水貂圆环病毒(Mink Circovirus , MiCV)感染引起的,以水貂腹泻为主要特征的病毒病。我国的水貂圆环病毒病最早于1978年在大连被发现,该病现已遍布我国水貂主要养殖区。水貂圆环病毒发现于2013年,迄今为止,水貂圆环病毒的致病机制尚不清楚,有效预防该病的疫苗尚未研制成功,在防治方面也无良好的办法,该病的防控已成为水貂养殖领域的难题。
为了解MiCV的遗传变异及流行情况,对实验室分离的MiCVHB3株进行全基因序列测定,结果表明,HB3株基因组全长1753bp(GenBank登录号为MK561562),与参考MiCV毒株全基因序列同源性为98.9%~99.7%,Rep和Cap基因的同源性分别为99.3%~99.9%和99.6%~100%。该毒株的遗传进化分析结果表明,HB3株与MiCV参考毒株亲缘关系较近,位于同一分支,而与PCV2、GoCV、DogCV1698和BtCVXOR亲缘关系较远,位于不同分支。同时对采集自辽宁省大连市和吉林省吉林市的239份临床样品进行MiCV的PCR检测,结果采集自大连的102份样品中PCR检测阳性数为54份,阳性检出率为52.9%;采集自吉林市的137份样品中PCR检测阳性样品数为79份,阳性检出率为57.7%,结果表明MiCV在大连市和吉林市感染阳性率较高。
应用生物软件分析实验室分离的MiCV流行毒株HB3株的Cap全长基因684bp,设计特异性引物,对其进行PCR扩增。将PCR扩增产物与原核表达载体pET-28a连接,获得重组表达质粒pET-28a-Cap,将其转入感受态细胞BL21(DE3),通过对IPTG诱导条件的优化,确定最佳条件为37℃诱导4h,IPTG终浓度为1mmol/L时蛋白表达效果最好,在大约33KD处获得特异性蛋白条带。对重组表达蛋白进行纯化,得到Cap纯化蛋白,WesternBlot检测结果表明,Cap蛋白能够与MiCV阳性血清发生特异性反应。
以纯化的重组Cap蛋白为包被抗原,建立了MiCV抗体检测的间接ELISA检测方法:重组蛋白作为包被抗原浓度为4.0μg/mL,4℃包被过夜;封闭液为含3%BSA的PBST;一抗血清的稀释度为1∶160,37℃孵育60min;兔抗貂酶标二抗37℃孵育60min;显色条件为37℃、20min。确定的临界值为0.347,即当样品OD450nm值大于0.347时,结果判定为阳性;样品OD450nm值小于0.347时,结果判定为阴性。该方法具有较好的特异性、敏感性和重复性。应用该方法对大连市和吉林市采集的血清样品进行检测,与PCR检测方法的符合率为90.79%。表明建立的用于检测MiCV抗体的间接ELISA方法结果可靠,可用于临床样品的检测。
为了解MiCV的遗传变异及流行情况,对实验室分离的MiCVHB3株进行全基因序列测定,结果表明,HB3株基因组全长1753bp(GenBank登录号为MK561562),与参考MiCV毒株全基因序列同源性为98.9%~99.7%,Rep和Cap基因的同源性分别为99.3%~99.9%和99.6%~100%。该毒株的遗传进化分析结果表明,HB3株与MiCV参考毒株亲缘关系较近,位于同一分支,而与PCV2、GoCV、DogCV1698和BtCVXOR亲缘关系较远,位于不同分支。同时对采集自辽宁省大连市和吉林省吉林市的239份临床样品进行MiCV的PCR检测,结果采集自大连的102份样品中PCR检测阳性数为54份,阳性检出率为52.9%;采集自吉林市的137份样品中PCR检测阳性样品数为79份,阳性检出率为57.7%,结果表明MiCV在大连市和吉林市感染阳性率较高。
应用生物软件分析实验室分离的MiCV流行毒株HB3株的Cap全长基因684bp,设计特异性引物,对其进行PCR扩增。将PCR扩增产物与原核表达载体pET-28a连接,获得重组表达质粒pET-28a-Cap,将其转入感受态细胞BL21(DE3),通过对IPTG诱导条件的优化,确定最佳条件为37℃诱导4h,IPTG终浓度为1mmol/L时蛋白表达效果最好,在大约33KD处获得特异性蛋白条带。对重组表达蛋白进行纯化,得到Cap纯化蛋白,WesternBlot检测结果表明,Cap蛋白能够与MiCV阳性血清发生特异性反应。
以纯化的重组Cap蛋白为包被抗原,建立了MiCV抗体检测的间接ELISA检测方法:重组蛋白作为包被抗原浓度为4.0μg/mL,4℃包被过夜;封闭液为含3%BSA的PBST;一抗血清的稀释度为1∶160,37℃孵育60min;兔抗貂酶标二抗37℃孵育60min;显色条件为37℃、20min。确定的临界值为0.347,即当样品OD450nm值大于0.347时,结果判定为阳性;样品OD450nm值小于0.347时,结果判定为阴性。该方法具有较好的特异性、敏感性和重复性。应用该方法对大连市和吉林市采集的血清样品进行检测,与PCR检测方法的符合率为90.79%。表明建立的用于检测MiCV抗体的间接ELISA方法结果可靠,可用于临床样品的检测。