目的：本研究主要目的是构建表达羊型布鲁氏菌M5株P39基因的逆转录病毒载体，为研发新型布鲁氏菌DNA疫苗奠定实验基础。 方法：1．目的基因的获取：对主要在我国流行以及对人致病性最高的羊型布鲁氏菌M5株扩增培养，并提取全基因组。根据Genbank中已公布的基因组序列选择已知的免疫原性高、主要诱导细胞介导免疫应答(cell-mediated immunity，CMI)的蛋白编码基因(P39基因)，设计特异性引物利用PCR扩增目的基因片段。经琼脂糖凝胶电泳纯化回收后，将P39基因与克隆载体pMD19-T载体连接并转化感受态E．coli DH5α，经蓝白筛选得到连接正确的重组质粒，将其命名为pMD19-T-P39质粒，并应用酶切、PCR以及基因测序等方法对其进行鉴定。2．共表达P39和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因逆转录病毒载体的构建：对上述得到的重组质粒pMD19-T-P39进行酶切后，将目的基因P39插入到携带EGFP基因的逆转录病毒载体pRev-IRES2-EGFP载体的多克隆位点(MCS)中。构建的逆转录病毒载体经限制性内切酶鉴定后，采用脂质体(Lipofectin)介导方法转染包装细胞(PT67)，经G418筛选后将得到的阳性克隆进行培养扩增。用收获的培养上清液感染鉴定细胞(NIH-3T3)测定每毫升病毒液中感染性病毒颗粒的数量。此时，包装细胞产生的假病毒即可作为携带羊型布鲁氏菌特异性抗原基因P39的DNA疫苗。 结果：通过PCR方法成功地获得了目的基因P39，并将其构建到克隆载体中。经鉴定分析并测序后，将目的基因构建到携带EGFP基因的逆转录病毒载体中。用重组逆转录病毒载体转染包装细胞，获得了产生逆转录病毒载体的细胞PT67/P39。最后进行病毒滴度检测结果为6×104CFU/ml。 结论：应用分子生物学的方法，成功构建了共表达EGFP和羊型布鲁氏菌P39基因的逆转录病毒载体，为进一步检测该新型疫苗的免疫效果奠定了一定的实验依据。