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第一部分miR-127-5p在特发性黄斑前膜玻璃体中的表达水平及意义研究目的:在视网膜类疾病中miRNAs存在差异表达并有重要调控作用,但是目前在特发性黄斑前膜病变中关于miRNAs的差异表达的研究较少,但是我们推测在特发性黄斑前膜中也存在miRNAs具有差异表达并具有重要的调控作用。因此在本实验中我们主要通过microarray技术筛选在特发性黄斑前膜患者玻璃体中以及对照组存在差异性表达的miRNAs。研究方法:为了寻找与特发性黄斑前膜相关的miRNAs,本研究采用microarray分析方法检测4例特发性黄斑前膜玻璃体组织和4例正常对照组玻璃体组织中miRNAs的表达变化。同时为了进一步验证试验结果,扩大临床样本,应用qRT-PCR方法检测20例正常对照组以及37例特发性黄斑前膜患者玻璃体组织进行验证。研究结果:特发性黄斑前膜玻璃体组织和正常对照玻璃体组织中存在61个miRNA存在差异表达,其中有24个(39.3%)miRNA在特发性黄斑前膜玻璃体中表现为上调,37个(60.7%)miRNA表现为下调。下调最明显的主要有:miR-127-5p、miR-486-3p、miR-660、miR-197、miR-425-5p、miR-518b、miR-376a、miR-145、miR-518d、miR-191、miR-221、miR-564。上调最明显的主要有:miR-454、miR-302a、miR-888、miR-302c、miR-1305、miR-519b-3p。miR-127-5p在特发性黄斑前膜玻璃体中下调最为显著,在37例特发性黄斑前膜玻璃体与20例对照组玻璃体中,qRT-PCR实验验证特发性黄斑前膜患者玻璃体中miR-127-5p表达水平显著下调,miR-127-5p在表达水平升高后可以抑制视网膜Müller细胞的增殖能力。结论:在特发性黄斑前膜患者中玻璃体存在与正常对照组不同的miRNAs表达谱,下调幅度最大的miR-127-5p经扩大样本qRT-PCR得到验证,其主要涉及细胞增殖调控,miR-127-5p在表达水平升高后可以抑制视网膜Müller细胞的细胞增殖能力。第二部分miR-127-5p调控大鼠视网膜Müller细胞增殖、侵袭、迁移与凋亡行为研究目的:在特发性黄斑前膜患者玻璃体中miR-127-5p显著下调,miR-127-5p外源表达水平升高可显著降低大鼠视网膜Müller细胞的增殖活性,因此我们推测miR-127-5p可能会调控在特发性黄斑前膜发生发展中有重要作用的的Müller细胞的其他行为,因此在本部分实验中我们将研究miR-127-5p表达水平升高后对于Müller细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡的影响。研究方法:使用miR-127-5p mimics(10μM、30μM、100μM)转染大鼠视网膜Müller细胞使miR-127-5p表达水平上调。使用CCK-8实验检测大鼠视网膜Müller细胞的增殖能力,Transwell侵袭实验检测大鼠视网膜Müller细胞侵袭能力,Transwell迁移实验检测大鼠视网膜Müller细胞迁移能力,流式细胞仪检测大鼠视网膜Müller细胞凋亡。研究结果:10μM、30μM、100μM的miR-127-5pmimics转染Müller细胞后可显著抑制Müller细胞增殖能力。miR-127-5p表达水平升高显著抑制大鼠视网膜Müller细胞侵袭能力以及迁移能力。miR-127-5p表达水平升高后显著促进了大鼠视网膜Müller细胞的凋亡能力。结论:miR-127-5p表达水平升高可以抑制大鼠视网膜Müller细胞增殖、侵袭和迁移能力,并促进视网膜Müller细胞的凋亡。第三部分miR-127-5p调控大鼠视网膜Müller细胞活性作用机制的研究研究目的:miR-127-5p表达水平升高后可以抑制大鼠视网膜Müller细胞增殖能力、侵袭能力、迁移能力,并促进Müller细胞凋亡,但是目前关于miR-127-5p对于视网膜Müller细胞的调控机制尚不明确,miRNAs通常可以通过调控靶基因表达水平从而调控生理活动,因此在本实验中我们首先需要鉴定miR-127-5p的靶基因并研究该靶基因是否在miR-127-5p对Müller细胞行为调控过程中发挥作用。研究方法:本课题采用Targetscan数据库预测并联合蛋白质谱组学等方法,寻找其潜在的靶点。通过qRT-PCR及蛋白质谱组学数据,并结合生物信息学分析,初步筛选出了miR-127-5p的潜在靶点GLUL,进一步的通过免疫印记法及qRT-PCR进行验证。通过蓄力比对,我们找到了miR-127-5p与其靶基因GLUL结合位点。并通过双荧光素报告基因以及结合位点序列突变进行验证,同时在在Müller细胞中转染miR-127-5p inhibitor,观察降低细胞内源性miR-127-5p后,是否能逆转GLUL的降低。观察应用si RNA敲低GLUL来低表达GLUL后对Müller细胞的活性的影响,为了进一步考察miRNA对细胞功能的影响是否是GLUL依赖的,在Müller细胞中转染miR-127-5p后,再过表达GLUL,观察是否够逆转miR-127-5p效应。研究结果:通过数据库预测及蛋白质谱筛选到GLUL是miR-127-5p潜在靶点。且在临床样本中检测发现特发性黄斑前膜患者玻璃体中GLUL m RNA表达水平在与正常人相比是明显升高的。细胞实验证明miR-127-5p能够明显抑制GLUL m RNA及蛋白水平,报告基因结果显示其能显著抑制GLUL 3’UTR活性。证明GLUL是miR-127-5p的靶基因,si RNA敲低GLUL也能明显抑制大鼠Müller的增殖、侵袭和迁移,并诱导明显的细胞凋亡,这与miR-127-5p效果一致。同时过表达GLUL能够部分的缓解miR-127-5p诱导的细胞活性的下降。结论:我们的研究表明miR-127-5p与特发性黄斑前膜患者存在负相关性。miR-127-5p对Müller细胞功能的影响是通过靶向GLUL来介导的。且临床样本中GLUL m RNA水平呈正相关。我们的研究发现了特发性黄斑前膜相关的调控机制:miR-127-5p直接靶向GLUL抑制其表达进而调控Müller细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡。miR-127-5p与GLUL可能是治疗或者阻止特发性黄斑前膜发展的潜在靶点。