【摘 要】
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玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN）是一种广泛存在于粮食作物中的真菌毒素,具有类雌激素毒性会严重危害人类和动物体的健康,粮食作物在被ZEN污染后,将无法继续食用,从而造成了大量的粮食的浪费。因此,建立一种可以广泛应用于粮食作物中的生物脱除方法,成为了目前食品安全领域的研究热点。本论文基于具有ZEN降解能力的黑曲霉FS10作为出发菌株,通过ZEN的胁迫方法,获得高降解活性的ZEN-S-FS
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玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN）是一种广泛存在于粮食作物中的真菌毒素,具有类雌激素毒性会严重危害人类和动物体的健康,粮食作物在被ZEN污染后,将无法继续食用,从而造成了大量的粮食的浪费。因此,建立一种可以广泛应用于粮食作物中的生物脱除方法,成为了目前食品安全领域的研究热点。本论文基于具有ZEN降解能力的黑曲霉FS10作为出发菌株,通过ZEN的胁迫方法,获得高降解活性的ZEN-S-FS10黑曲霉菌株,并分离纯化鉴定出新型ZEN降解酶FSZ（与已报道的ZEN降解酶同源性低于10%）,并分析降解机制和降解产物。并根据细胞毒性实验分析其体外毒性,为ZEN的高效安全降解提供了一定的理论基础。本文的主要研究内容可以归结为以下3点:1.黑曲霉FS10对ZEN降解能力的优化与代谢机制探究。采用ZEN（1.0μg/m L）对黑曲霉FS10进行胁迫24h,并循环胁迫5次,发现经过ZEN胁迫后的菌株ZEN-S-FS10,在1.0×10~6CFU/m L的孢子浓度下,对于1.0μg/m L的ZEN降解率达96.00%,与原有菌株FS10的降解率（84.56%）相比,提升了约11.44%。同时根据18s r DNA测序结果表明胁迫前后在基因层面无明显变化。并根据胁迫前后菌株的代谢组学数据分析,发现了两种菌株降解能力的差异在于尤其在DL-天冬酰胺所代表的氨基酸合成和蜜二糖所代表的糖代谢过程出现了明显上调,从而导致菌株对ZEN的代谢能力提升。这可能为一种促进ZEN-S-FS10降解率提升的因素。在针对胁迫后菌株ZEN-S-FS10的性质探究中,发现ZEN-S-FS10对ZEN的降解能力经过多次传代后仍然保持在95%-97%之间,可以稳定存在。并且当孢子浓度为10~4CFU/m L降解1.0μg/m L的ZEN时,28h的降解率可以达到96.00%以上。2.胁迫后黑曲霉ZEN-S-FS10的ZEN降解酶鉴定与结构信息分析。通过对ZEN-S-FS10的降解部位探究,发现了其主要具有ZEN降解能力的部位为其生长过程中所分泌的胞外酶,并且通过对胞外酶液采用（?）KTA pure蛋白纯化系统进行分离纯化,获得了一种可以具有降解ZEN能力的黑曲霉胞外酶FSZ,该酶的分子量大小为62.4 k Da。同时还探究了FSZ的相关性质。FSZ在28-38℃的温度范围内对1.0μg/m L的ZEN具有80%左右的降解率。此外,当培养p H≤7时,不会影响FSZ对ZEN的降解率。并且,Cd2+、Mn2+等金属离子的存在也会影响FSZ对ZEN的降解。但是,Ca2+的存在会对ZEN的降解率具有提升作用（ZEN降解率＞80%）。通过酶动力学分析发现其动力学参数为Vmax=6.52μg·m L-1·h-1,Km=0.85μg/m L,均优于已知的ZEN降解酶。并且预测了FSZ的蛋白三维空间结构,并对FSZ与ZEN进行分子对接,发现了3个与ZEN结合的位点（PHE307、THR55、GLU129）,形成三角形结合域,从而可以使ZEN与FSZ发生化学结合。3.ZEN降解产物鉴定及其体外毒性探究。采用高分辨UPLC-MSMS对ZEN-S-FS10的胞外粗酶液与纯化后的FSZ的ZEN的降解产物进行了鉴定,共发现一种主要的ZEN降解产物:产物A:C18H26O4,相对分子量306.18 g/mo L,一种主要的低毒性转化产物:产物B:Zearalenone 4-sulfate,(C18H22O8S),相对分子量398.4 g/mo L;通过HepG2细胞对ZEN及其产物的体外毒性进行了评价,发现ZEN侵染下,细胞难以保持正常的形态,但是产物处理后则会使细胞形态趋于正常。并且在ZEN处理下,细胞的存活率保持在较低水平,而产物处理组的细胞存活率则明显高于ZEN处理组。此外,我们还发现在不同浓度下的ZEN与ZEN产物处理下,以及对细胞处理不同的时间,ZEN产物的细胞存活率明显高于ZEN标准品,因此ZEN产物的体外毒性明显低于ZEN标准品。综上所述,通过对FS10的降解能力的提升,我们获得了一种可用于ZEN降解的降解酶,并验证了其降解组产物的结构与毒性。这为食品中ZEN的安全降解提供了一个全新的思路。
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