【摘 要】
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乳酰-N-新四糖是人乳寡糖中重要组成成分,可作为益生元,具有调节肠道菌群等生理功能。已被批准作为食品配料加入到配方奶粉当中。β-1,4-半乳糖基转移酶作为合成乳酰-N-新四糖的关键酶,目前鉴定报道较少,且和大多数糖基转移酶一样在大肠杆菌异源表达过程中容易形成包涵体。本课题筛选得到一种来源Histophilus somni的可在大肠杆菌中高水平可溶性表达的新型β-1,4-半乳糖基转移酶（Hs-β-1
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乳酰-N-新四糖是人乳寡糖中重要组成成分,可作为益生元,具有调节肠道菌群等生理功能。已被批准作为食品配料加入到配方奶粉当中。β-1,4-半乳糖基转移酶作为合成乳酰-N-新四糖的关键酶,目前鉴定报道较少,且和大多数糖基转移酶一样在大肠杆菌异源表达过程中容易形成包涵体。本课题筛选得到一种来源Histophilus somni的可在大肠杆菌中高水平可溶性表达的新型β-1,4-半乳糖基转移酶（Hs-β-1,4-Gal T）,并研究了该酶的酶学性质,利用该酶构建了乳酰-N-新四糖的合成途径,和蛋白结晶初步研究。本课题的总结如下:（1）Hs-β-1,4-Gal T的最适反应条件表明,转糖苷酶活的最适p H和最适温度分别为p H 6.0和30℃,且该酶具有严格的Mg2+依赖性。在弱酸性条件下可以保持90%的残余酶活,维持较高的催化能力。Nano DSC结果表明Hs-β-1,4-Gal T解折叠温度（Tm）为44.49°C。体外酶法合成乳酰-N-新四糖的研究表明,该酶以1.5 m M乳酰-N-三糖II（LNT II）、1.5 m M尿苷二磷酸半乳糖（UDP-Gal）为底物,可生产合成0.43 m M乳酰-N-新四糖（LNn T）,平衡转化率为33%。（2）基于Hs-β-1,4-gal T基因,在E.coli BL21（DE3）衍生菌株E42-ΔWNL中构建了具有合成LNn T能力的菌株。首先,将Hs-β-1,4-Gal T编码基因构建到载体p ACYCDuet-1中,获得重组质粒p ACYC-Hs-gal T;随后,结合重组质粒p RSFDuet-glm MUS和p ETDuet-lgt A,在E.coli BL21（DE3）中过表达合成途径的6个关键酶Glm S、Glm M、Glm U、Gal T、Nm-Lgt A和Hs-β-1,4-gal T;之后,重组菌株摇瓶发酵,以甘油为碳源,乳糖和半乳糖为底物,摇瓶发酵培养96 h后,LNn T的产量达到了0.66 g/L;最后,敲除编码转录抑制因子的gal R和gal S基因,宿主菌株E43-Δgal SΔgal R经过摇瓶发酵培养96 h,LNn T的产量达到了0.72 g/L。（3）通过Ni2+亲和层析及凝胶过滤层析柱获得了高纯度目标蛋白Hs-β-1,4-Gal T。凝胶过滤层析结果表明,重组酶在缓冲液中的聚集状态均一。SDS-PAGE结果表明重组酶的纯度在98%以上,满足结晶的要求。使用坐滴法进行蛋白结晶初筛,18℃培养两周长出晶体,后经悬滴法优化后,最终获得一套最高分辨率约5（?）的衍射数据。
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