论文部分内容阅读
T-2毒素是粮食中霉菌毒素的主要来源,对人类的消化系统、神经系统、生殖系统都有毒害作用。这主要是因为T-2毒素通过多种方式诱导细胞凋亡。而细胞凋亡在生物体的生长发育和内环境稳定中起着重要的作用,识别和监测毒素诱导的细胞凋亡进程对于理解毒素毒性机制和推进凋亡研究至关重要。由于具有优异的光学性质,金纳米材料（Gold nanomaterials,AuNMs）在构建表面增强拉曼散射（Surface-enhanced Raman scattering,SERS）或荧光生物传感器方面具有广阔的发展前景。在尖端效应存在下,多分支的金纳米粒子通常表现出更高的SERS活性。借助识别分子,AuNMs被广泛应用于细胞内检测及原位成像。其中,功能核酸（Functional nucleic acid,FNA）作为一种新型识别分子,具有合成简单、修饰方便、价格便宜等优点。然而基于功能核酸的检测方法尚处于发展阶段,具有重要研究意义。基于金纳米材料和功能核酸的优势,本课题制备了荧光-SERS双模式纳米传感探针以及荧光多色传感探针,分别用于T-2毒素诱导的细胞凋亡标志物的定量检测及成像,为研究毒素诱导细胞的凋亡机制提供了新的有效平台。具体研究内容如下:1.（脱氧核酶）DNAzyme-金纳米星（Gold nanostars,AuNSs）探针用于活细胞中钙离子的SERS-荧光双模检测和成像。作为重要的第二信使,Ca2+在T-2毒素诱导的细胞凋亡过程中发挥着关键作用。在这项工作中,开发了一种包含“打开”荧光和“关闭”SERS的新型双模式纳米探针,以用于选择性地灵敏检测Ca2+。该探针结合了AuNSs和DNAzyme（识别元件）。当Cy5修饰的底物链与AuNSs表面的酶链杂交后,形成Ca2+特异性DNAzyme。此时,荧光被淬灭,SERS信号强。当检测体系中存在Ca2+时,Cy5标记的底物链被切割并从AuNSs表面释放,导致SERS信号减弱和荧光信号恢复。线性范围为0.4μM-50μM,最低检测限为0.021μM。利用两种信号变化成功监测了T-2毒素诱导的细胞凋亡过程中的Ca2+超载事件。所提出的纳米探针结合了SERS和荧光的优点,在各种细胞系中具有良好的通用性,有助于更好地理解Ca2+在细胞通路中的作用。2.DNA修饰的金纳米花（Gold nanoflowers,AuNFs）对细胞凋亡中小分子硫醇的荧光-拉曼双模式定量检测与成像。T-2毒素诱导的氧化应激可导致细胞内抗氧化系统崩溃和细胞凋亡。而小分子硫醇（尤其是谷胱甘肽）在保持氧化还原稳态方面发挥着关键作用。在这项工作中,双模式纳米传感器（C2-C1-AuNFs）被设计用于检测小分子硫醇。DNA被Cy5和二硫键（识别元件）修饰。AuNFs被用作荧光猝灭和SERS增强基底。然而,小分子硫醇可以裂解二硫键并释放修饰Cy5的DNA短链,导致荧光信号恢复和SERS信号降低。C2-C1-AuNFs对以谷胱甘肽为代表的小分子硫醇反应灵敏,线性范围为0.01 m M-3 m M,最低检测限为913 n M。重要的是,C2-C1-AuNFs已成功应用于T-2毒素诱导的细胞凋亡过程中小分子硫醇的原位成像和定量监测。它结合了荧光和SERS的双重优势,在其他人类细胞系中具有通用性。实验结果表明,C2-C1-AuNFs是小分子硫醇检测良好的光学成像工具,有望应用于相关生理过程的原位研究中。3.基于对称金星（Symmetrical gold nanostars,S-AuNSs）的核酸多色荧光探针实时原位观察P53介导的细胞凋亡通路的顺序激活。P53介导的凋亡通路是非常重要的信号分子集合,在细胞凋亡中起关键作用。实时监测信号通路中P53 m RNA、Bax m RNA和Cyt c的上下游激活关系,对于了解这些信号分子在生理活动中的调控机制具有重要意义。在这项工作中,开发了一种二氧化硅包被的对称金纳米星探针（S-AuNSs@SiO2-P）,用于T-2毒素诱导的细胞凋亡过程中P53 m RNA、Bax m RNA和Cyt c的高灵敏度原位实时成像。在S-AuNSs@SiO2表面通过酰胺键修饰P53 m RNA识别链、Bax m RNA识别链以及Cyt c适配体互补链,通过互补配对准则连接上修饰有荧光基团（FAM、TAMRA和Cy5）的互补链、适配体链,构建多色荧光探针。没有靶标时,三种荧光基团的荧光被有效淬灭。在靶标存在下,DNA双链被迫解开,荧光链与靶标形成双链体或复合物,从而导致荧光恢复。由于具有20个对称“热点”,基于S-AuNSs的探针表现出了优异的光学性能。在对T-2毒素诱导的Hela细胞凋亡的实时荧光成像中,P53 m RNA、Bax m RNA和Cyt c对应的荧光信号依次开启。因此,S-AuNSs@SiO2-P是实时原位监测P53介导的细胞凋亡通路信号分子级联激活的有效工具。它可以准确分析正向调控的信号通路,并很容易适用于其他信号分子的原位检测。