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背景：
银屑病属于皮肤科常见的、慢性的炎症性疾病。在临床上，银屑病病人的皮肤上典型的病理特征为鳞屑及边界清晰的椭圆形的红色斑块。因为银屑病的病程及发病周期较长，并且长时间伴随瘙痒，银屑病患者在精神上常承受很大的压力，影响病人正常的生活。多种环境因素，如压力、微生物菌群变化、药物及吸烟等均能够诱发银屑病的发生。近年来的研究发现，多种免疫细胞如T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、抗原提呈细胞(APC)及角质形成细胞(KC)均在银屑病的免疫异常紊乱中发挥重要的作用。其中，作为银屑病皮损及鳞屑产生的主要原因，KC细胞的过度增殖及KC细胞在银屑病发病中的关键地位引起了越来越多学者的关注。首先，KC细胞作为靶细胞，能够被T细胞分泌的多种促炎性细胞因子如IFN-γ、IL-22及IL-17激活。其次，被激活的KC细胞能释放促炎及趋化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11及TNF-α等，募集免疫细胞介导银屑病皮损局部免疫微环境的紊乱。KC细胞和各种免疫细胞形成炎症反应环路，参与到银屑病发病的各个环节。因此，研究KC细胞异常活化的机制及调控KC细胞过度增殖的关键分子是了解银屑病发病的关键因素。
角蛋白17(K17)属于中间丝蛋白家族成员，作为细胞骨架的重要结构组分，角蛋白17在维持细胞形态及表皮细胞的完整性上发挥重要作用。近年来研究发现，K17在调控多种生物学功能，如细胞增殖及生长、细胞分化及介导炎症发生中均发挥作用。在正常人及银屑病病人中，K17存在差异性的表达。最早研究发现，K17在银屑病病人的基底上层细胞显著的高表达，而在正常人皮损中并未检测到K17的表达。之前文献报道及课题组的研究发现，主要由辅助性T细胞1(Th1)分泌的IFN-γ及Th17分泌的IL-17及IL-22均能够通过激活不同的信号通路诱导K17在银屑病表皮的高表达。除了炎症因子的调控，我们还发现转录因子小鼠核因子E2相关因子2(Nrf2)能够结合到K17基因的抗氧化反应元件(ARE)序列，促进K17在银屑病中的表达。并且，K17的磷酸化也能够调控K17的蛋白稳定性及K17和其它蛋白的相互作用。
蛋白-泛素酶体系统是从翻译后修饰水平调控蛋白的一种重要方式。除了介导底物被泛素酶体降解之外，泛素化过程还能够调控细胞凋亡、炎症信号转导、细胞代谢、自噬及蛋白相互作用等生物学过程。在银屑病中，已经发现多种泛素化酶的单核苷酸多态性(SNP)位点。TNFAIP3编码泛素化修饰酶A20，全基因组关联分析(GWAS)发现，TNFAIP3的SNP与银屑病发病相关。此外，E3连接酶Trim32在银屑病表皮高表达。其能够通过结合p65亚基激活NF-κB活性，促进趋化因子CCL20的分泌，趋化中性粒细胞促进炎症反应，参与银屑病的发病。以上结果提示，泛素-蛋白酶体系统紊乱极有可能参与到银屑病的发病。基于此，我们课题提出如下的假说：第一，角蛋白K17能够受到泛素化修饰的调控；第二，K17泛素化修饰后能够调控KC细胞的生物学功能。
目的：
1.明确银屑病KC细胞中K17泛素化修饰的改变；
2.明确泛素化K17的特异性的泛素化结合/连接酶；
3.阐明泛素化结合/连接酶对K17蛋白稳定性的调控及相关机制；
4.阐明K17泛素化修饰对KC生物学功能的影响，明确K17泛素化修饰在参与银屑病患者发病中的作用。
方法：
1.KC中K17泛素化修饰改变的分析：利用免疫共沉淀技术(IP)在角质形成细胞系HaCaT中进行K17的IP实验；Westernblotting实验分析K17是否能受到泛素化修饰；
2.分析及筛选K17的特异性E2结合酶/E3连接酶：质谱分析结合K17的免疫共沉淀，筛选相关的泛素化结合/连接酶；在体外HaCaT细胞中完成K17的免疫共沉淀后，Westernblotting验证泛素化结合/连接酶和K17的相互作用；
3.E2结合酶/E3酶对K17蛋白表达及稳定性的影响：首先利用Westernblotting、Real-timePCR、组织免疫荧光及组织化学方法分别检测泛素化结合/连接酶在银屑病表皮中的表达；其次构建相关泛素化结合/连接酶的干涉片段及过表达慢病毒或质粒，在HaCaT细胞中进行干涉及过表达，Westernblotting、细胞免疫荧光、Real-timePCR检测K17的表达变化及放线菌素实验检测K17的蛋白半衰期；
4.E2结合酶/E3连接酶对K17蛋白表达及稳定性的具体调控机制研究：在过表达或干涉相关泛素化结合/连接酶的HaCaT细胞中，进行K17的免疫共沉淀实验，Westernblotting检测K17蛋白上赖氨酸48(K48)链及K63链连接；
5.K17泛素化对KC增殖及炎症等功能的影响：首先利用免疫共沉淀技术鉴定K17作用蛋白的变化，观察K17能否和影响角质形成细胞增殖和炎症因子分泌的信号通路分子AKT/STAT3/STAT1/MAPK/NF-κB结合。通过免疫荧光及Westernblotting观察K17泛素化后这些信号通路的变化，最终阐明K17泛素化修饰对KC增殖及炎症等功能的影响；
6.K17泛素化修饰对小鼠银屑病样表型的影响：根据鉴定得到的K17相互作用的泛素结合酶，构建泛素连接酶的干涉片段或过表达慢病毒，特异性的抑制K17的泛素化修饰。在咪喹莫特(IMQ)诱导的银屑病的小鼠模型中，在耳部涂抹泛素连接酶的干涉片段或过表达慢病毒进行治疗，H&E染色观察小鼠表皮厚度的变化，免疫荧光观察小鼠表皮细胞增殖程度及炎症浸润程度的变化，评价泛素连接酶的干涉片段或过表达慢病毒治疗小鼠银屑病样表型的作用。
结果：
1.KC中K17能受到泛素化的修饰调控：通过K17的IP实验结合Westernblotting发现K17能够被泛素化修饰；
2.Trim21是泛素化修饰K17的E3连接酶：通过质谱分析K17相互作用的蛋白，发现了泛素系统相关的E3连接酶Trim21；通过体外HaCaT细胞进行K17的IP实验，发现K17能够和Trim21结合；免疫荧光观察同样发现银屑病皮损中Trim21和K17存在共定位现象；
3.Trim21在银屑病表皮中高表达：通过Westernblotting及Real-timePCR分离银屑病病人真表皮后检测发现Trim21的蛋白及mRNA表达量在银屑病病人表皮中显著升高；免疫荧光及免疫组化同样发现Trim21在银屑病患者表皮中表达显著升高。在HaCaT细胞及银屑病病人皮损石蜡组织中进行的免疫荧光发现，Trim21在表皮中及HaCaT角质形成细胞系中和K17均存在共定位现象；
4.IFN-γ诱导银屑病KC中Trim21高表达：Westernblotting及Real-timePCR结果发现，IFN-γ能促进角质形成细胞中Trim21的表达，而TNF-α、IL-17及IL-22对Trim21的表达并没有显著激活作用；
5.表皮中高表达的Trim21泛素化K17后增强K17的稳定性：HaCaT细胞中干涉Trim21后，Westernblotting实验发现K17蛋白稳定性显著下降，免疫荧光检测K17的荧光强度显著下降；过表达Trim21后，Westernblotting实验发现K17蛋白稳定性升高，免疫荧光检测发现K17的荧光强度也显著升高。进一步通过放线菌素半衰期实验发现干涉Trim21后K17的半衰期下降；
6.Trim21通过泛素分子间的K63链泛素修饰K17：在过表达Trim21的慢病毒转染细胞中进行K17的免疫共沉淀实验，Westernblotting结果未检测到K17上存在K48链修饰，而在过表达Trim21的HaCaT细胞中K17的K63链连接显著增加；
7.Trim21能通过泛素化K17促进STAT3通路活化：免疫共沉淀发现K17能和STAT3相互作用；过表达Trim21的HaCaT细胞和对照组细胞相比，STAT3的入核、磷酸化STAT3激活及STAT3的下游分子cyclinD1表达显著增加；在过表达Trim21的细胞中干涉K17后，STAT3的通路激活受到抑制；
8.Trim21能通过泛素化K17促进KC的增殖：CCK8检测发现干涉Trim21后HaCaT细胞增殖下降，过表达Trim21能显著增强HaCaT细胞增殖；在过表达Trim21的HaCaT细胞中干涉K17，HaCaT细胞增殖受到显著抑制；
9.干涉Trim21能显著改善IMQ在Balb/c小鼠中诱导的银屑病样的表型：小鼠耳部涂抹IMQ构建银屑病样小鼠模型，涂抹Trim21干涉片段治疗后，H&E结果显示小鼠耳部的表皮增厚现象减轻，免疫荧光结果显示在涂抹Trim21干涉片段后，和IMQ对照组相比，小鼠表皮细胞的增殖标志分子Ki67及PCNA表达下降；免疫荧光结果同样发现小鼠皮损中浸润的炎症细胞如CD4+T、中性粒及巨噬细胞均显著下降。
结论：
在银屑病表皮中，IFN-γ能促进KC细胞高表达Trim21，E3连接酶Trim21进一步通过K63链结合并泛素化修饰K17，增强K17的蛋白稳定性，促进K17和STAT3的结合，激活STAT3的通路，从而影响KC的增殖，参与银屑病的发病。本文首次发现了KC细胞中K17能够受到泛素化修饰，揭示蛋白的翻译后修饰方式-泛素化也是调控K17表达的重要机制；本文揭示了以泛素化K17的E3连接酶Trim21为靶点治疗银屑病可能是未来研究的热点，指出针对泛素系统开发抑制剂可能是未来治疗银屑病的新方向。
银屑病属于皮肤科常见的、慢性的炎症性疾病。在临床上，银屑病病人的皮肤上典型的病理特征为鳞屑及边界清晰的椭圆形的红色斑块。因为银屑病的病程及发病周期较长，并且长时间伴随瘙痒，银屑病患者在精神上常承受很大的压力，影响病人正常的生活。多种环境因素，如压力、微生物菌群变化、药物及吸烟等均能够诱发银屑病的发生。近年来的研究发现，多种免疫细胞如T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、抗原提呈细胞(APC)及角质形成细胞(KC)均在银屑病的免疫异常紊乱中发挥重要的作用。其中，作为银屑病皮损及鳞屑产生的主要原因，KC细胞的过度增殖及KC细胞在银屑病发病中的关键地位引起了越来越多学者的关注。首先，KC细胞作为靶细胞，能够被T细胞分泌的多种促炎性细胞因子如IFN-γ、IL-22及IL-17激活。其次，被激活的KC细胞能释放促炎及趋化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11及TNF-α等，募集免疫细胞介导银屑病皮损局部免疫微环境的紊乱。KC细胞和各种免疫细胞形成炎症反应环路，参与到银屑病发病的各个环节。因此，研究KC细胞异常活化的机制及调控KC细胞过度增殖的关键分子是了解银屑病发病的关键因素。
角蛋白17(K17)属于中间丝蛋白家族成员，作为细胞骨架的重要结构组分，角蛋白17在维持细胞形态及表皮细胞的完整性上发挥重要作用。近年来研究发现，K17在调控多种生物学功能，如细胞增殖及生长、细胞分化及介导炎症发生中均发挥作用。在正常人及银屑病病人中，K17存在差异性的表达。最早研究发现，K17在银屑病病人的基底上层细胞显著的高表达，而在正常人皮损中并未检测到K17的表达。之前文献报道及课题组的研究发现，主要由辅助性T细胞1(Th1)分泌的IFN-γ及Th17分泌的IL-17及IL-22均能够通过激活不同的信号通路诱导K17在银屑病表皮的高表达。除了炎症因子的调控，我们还发现转录因子小鼠核因子E2相关因子2(Nrf2)能够结合到K17基因的抗氧化反应元件(ARE)序列，促进K17在银屑病中的表达。并且，K17的磷酸化也能够调控K17的蛋白稳定性及K17和其它蛋白的相互作用。
蛋白-泛素酶体系统是从翻译后修饰水平调控蛋白的一种重要方式。除了介导底物被泛素酶体降解之外，泛素化过程还能够调控细胞凋亡、炎症信号转导、细胞代谢、自噬及蛋白相互作用等生物学过程。在银屑病中，已经发现多种泛素化酶的单核苷酸多态性(SNP)位点。TNFAIP3编码泛素化修饰酶A20，全基因组关联分析(GWAS)发现，TNFAIP3的SNP与银屑病发病相关。此外，E3连接酶Trim32在银屑病表皮高表达。其能够通过结合p65亚基激活NF-κB活性，促进趋化因子CCL20的分泌，趋化中性粒细胞促进炎症反应，参与银屑病的发病。以上结果提示，泛素-蛋白酶体系统紊乱极有可能参与到银屑病的发病。基于此，我们课题提出如下的假说：第一，角蛋白K17能够受到泛素化修饰的调控；第二，K17泛素化修饰后能够调控KC细胞的生物学功能。
目的：
1.明确银屑病KC细胞中K17泛素化修饰的改变；
2.明确泛素化K17的特异性的泛素化结合/连接酶；
3.阐明泛素化结合/连接酶对K17蛋白稳定性的调控及相关机制；
4.阐明K17泛素化修饰对KC生物学功能的影响，明确K17泛素化修饰在参与银屑病患者发病中的作用。
方法：
1.KC中K17泛素化修饰改变的分析：利用免疫共沉淀技术(IP)在角质形成细胞系HaCaT中进行K17的IP实验；Westernblotting实验分析K17是否能受到泛素化修饰；
2.分析及筛选K17的特异性E2结合酶/E3连接酶：质谱分析结合K17的免疫共沉淀，筛选相关的泛素化结合/连接酶；在体外HaCaT细胞中完成K17的免疫共沉淀后，Westernblotting验证泛素化结合/连接酶和K17的相互作用；
3.E2结合酶/E3酶对K17蛋白表达及稳定性的影响：首先利用Westernblotting、Real-timePCR、组织免疫荧光及组织化学方法分别检测泛素化结合/连接酶在银屑病表皮中的表达；其次构建相关泛素化结合/连接酶的干涉片段及过表达慢病毒或质粒，在HaCaT细胞中进行干涉及过表达，Westernblotting、细胞免疫荧光、Real-timePCR检测K17的表达变化及放线菌素实验检测K17的蛋白半衰期；
4.E2结合酶/E3连接酶对K17蛋白表达及稳定性的具体调控机制研究：在过表达或干涉相关泛素化结合/连接酶的HaCaT细胞中，进行K17的免疫共沉淀实验，Westernblotting检测K17蛋白上赖氨酸48(K48)链及K63链连接；
5.K17泛素化对KC增殖及炎症等功能的影响：首先利用免疫共沉淀技术鉴定K17作用蛋白的变化，观察K17能否和影响角质形成细胞增殖和炎症因子分泌的信号通路分子AKT/STAT3/STAT1/MAPK/NF-κB结合。通过免疫荧光及Westernblotting观察K17泛素化后这些信号通路的变化，最终阐明K17泛素化修饰对KC增殖及炎症等功能的影响；
6.K17泛素化修饰对小鼠银屑病样表型的影响：根据鉴定得到的K17相互作用的泛素结合酶，构建泛素连接酶的干涉片段或过表达慢病毒，特异性的抑制K17的泛素化修饰。在咪喹莫特(IMQ)诱导的银屑病的小鼠模型中，在耳部涂抹泛素连接酶的干涉片段或过表达慢病毒进行治疗，H&E染色观察小鼠表皮厚度的变化，免疫荧光观察小鼠表皮细胞增殖程度及炎症浸润程度的变化，评价泛素连接酶的干涉片段或过表达慢病毒治疗小鼠银屑病样表型的作用。
结果：
1.KC中K17能受到泛素化的修饰调控：通过K17的IP实验结合Westernblotting发现K17能够被泛素化修饰；
2.Trim21是泛素化修饰K17的E3连接酶：通过质谱分析K17相互作用的蛋白，发现了泛素系统相关的E3连接酶Trim21；通过体外HaCaT细胞进行K17的IP实验，发现K17能够和Trim21结合；免疫荧光观察同样发现银屑病皮损中Trim21和K17存在共定位现象；
3.Trim21在银屑病表皮中高表达：通过Westernblotting及Real-timePCR分离银屑病病人真表皮后检测发现Trim21的蛋白及mRNA表达量在银屑病病人表皮中显著升高；免疫荧光及免疫组化同样发现Trim21在银屑病患者表皮中表达显著升高。在HaCaT细胞及银屑病病人皮损石蜡组织中进行的免疫荧光发现，Trim21在表皮中及HaCaT角质形成细胞系中和K17均存在共定位现象；
4.IFN-γ诱导银屑病KC中Trim21高表达：Westernblotting及Real-timePCR结果发现，IFN-γ能促进角质形成细胞中Trim21的表达，而TNF-α、IL-17及IL-22对Trim21的表达并没有显著激活作用；
5.表皮中高表达的Trim21泛素化K17后增强K17的稳定性：HaCaT细胞中干涉Trim21后，Westernblotting实验发现K17蛋白稳定性显著下降，免疫荧光检测K17的荧光强度显著下降；过表达Trim21后，Westernblotting实验发现K17蛋白稳定性升高，免疫荧光检测发现K17的荧光强度也显著升高。进一步通过放线菌素半衰期实验发现干涉Trim21后K17的半衰期下降；
6.Trim21通过泛素分子间的K63链泛素修饰K17：在过表达Trim21的慢病毒转染细胞中进行K17的免疫共沉淀实验，Westernblotting结果未检测到K17上存在K48链修饰，而在过表达Trim21的HaCaT细胞中K17的K63链连接显著增加；
7.Trim21能通过泛素化K17促进STAT3通路活化：免疫共沉淀发现K17能和STAT3相互作用；过表达Trim21的HaCaT细胞和对照组细胞相比，STAT3的入核、磷酸化STAT3激活及STAT3的下游分子cyclinD1表达显著增加；在过表达Trim21的细胞中干涉K17后，STAT3的通路激活受到抑制；
8.Trim21能通过泛素化K17促进KC的增殖：CCK8检测发现干涉Trim21后HaCaT细胞增殖下降，过表达Trim21能显著增强HaCaT细胞增殖；在过表达Trim21的HaCaT细胞中干涉K17，HaCaT细胞增殖受到显著抑制；
9.干涉Trim21能显著改善IMQ在Balb/c小鼠中诱导的银屑病样的表型：小鼠耳部涂抹IMQ构建银屑病样小鼠模型，涂抹Trim21干涉片段治疗后，H&E结果显示小鼠耳部的表皮增厚现象减轻，免疫荧光结果显示在涂抹Trim21干涉片段后，和IMQ对照组相比，小鼠表皮细胞的增殖标志分子Ki67及PCNA表达下降；免疫荧光结果同样发现小鼠皮损中浸润的炎症细胞如CD4+T、中性粒及巨噬细胞均显著下降。
结论：
在银屑病表皮中，IFN-γ能促进KC细胞高表达Trim21，E3连接酶Trim21进一步通过K63链结合并泛素化修饰K17，增强K17的蛋白稳定性，促进K17和STAT3的结合，激活STAT3的通路，从而影响KC的增殖，参与银屑病的发病。本文首次发现了KC细胞中K17能够受到泛素化修饰，揭示蛋白的翻译后修饰方式-泛素化也是调控K17表达的重要机制；本文揭示了以泛素化K17的E3连接酶Trim21为靶点治疗银屑病可能是未来研究的热点，指出针对泛素系统开发抑制剂可能是未来治疗银屑病的新方向。