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本实验室前期研究工作中发现,添加1.5%DMSO于重组CHO细胞的培养环境中使HBsAg的产量提高了80%以上,但同时造成了胞内HBsAg的大量积累,其含量是对照组的9倍以上。本文将XBP1基因转入表达HBsAg的CHO细胞中,希望利用XBP1改善细胞对重组蛋白的翻译后加工能力,解决HBsAg的胞内积累问题。并且通过考察细胞有无发生内质网应激反应,以及蛋白二硫键的变化,分析了胞内HBsAg积累部位以及积累原因。
本文通过RT-PCR的方法,成功获得了CHO细胞中的XBP1序列,然后构建了表达质粒pcDNA3.1-XBP1(s)。应用阳离子脂质体转染技术,将质粒成功转染至CHO细胞中,通过G418抗药筛选,共获得56株克隆。分别用RT-PCR及real-time PCR进行检测,XBP1在单克隆细胞株中的表达量分别提高了2-9倍不等。但分析这些克隆在1.5%DMSO下HBsAg的胞内积累情况,发现没有明显改善。
本文进一步发现在细胞发生内质网应激反应的情况下,XBP1能够促进HBsAg分泌,而通过检测标志内质网应激反应的两个基因的表达情况,发现DMSO作用下CHO-HBsAg细胞并未发生明显的内质网应激反应;此外,通过测定DMSO作用下总蛋白中二硫键含量变化,发现DMSO增加了蛋白中二硫键的含量。由此初步可以确定在DMSO作用下,HBsAg能够顺利折叠,顺利离开内质网,蛋白的积累发生在其它部位。