随着医疗水平的迅速提高,用于人工器官、外科修复或理疗修复的生物医学材料受到越来越多的重视。应用于各种组织修复的辅助缝合制品或单独应用于组织闭合的软组织粘合剂也得到了广泛的关注。目前国内应用于临床的软组织粘合剂主要有纤维蛋白类及氰基丙烯酸酯类,而国外在基于上述两种类型粘合剂的基础上还研究开发了一种作为辅助性止血材料应用于急性A型主动脉夹层修复的软组织粘合剂,商品名为BioGlue。它以提纯的质量分数为45%的牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)与质量分数为10%的戊二醛为组成成分,使用时,按照体积比4：1的比例由特定的双筒注射器在待修复处进行适量涂抹。BSA中带有侧链伯胺基的赖氨酸、待修复处的组织蛋白及戊二醛的醛基之间发生亲核加成反应,从而产生化学性封闭作用而达到辅助治疗的目的。然而,随着BioGlue临床应用的不断增加,针对它的不良反应报告也逐日增多,诸如局部组织坏死、血栓症、器官功能衰竭等。因此,研制开发一款新型的医用软组织粘合剂势在必行。本课题以国外已上市产品BioGlue为参照,旨在研制一种新型医用软组织粘合剂,以丰富国内医用粘合剂的市场。选取人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)、明胶及戊二醛为基本组成成分,通过对各种医用软组织粘合剂配方的筛选、体外理化性能测定、体外毒性测定,并对筛选出的粘合剂进行了体内系统性的功能评价,包括材料的体内降解率、体内生物相容性以及急性全身毒性,明确优于BioGlue或与之各方面性能相当的新型医用软组织粘合剂。1新型软组织粘合剂组成成分及浓度、比例的筛选借鉴前人研究基础,以国外上市产品BioGlue为对照,固定各种蛋白质与戊二醛的体积比4：1,通过测定胶凝时间,分别筛选出合适的蛋白质浓度与戊二醛浓度,以此确定每一种新型软组织粘合剂的组成。实验确定的各组样品分别为：对照样品S1为BioGlue,即组成为45%的BSA溶液与10%的戊二醛溶液；样品S2为45%的HSA溶液与10%的戊二醛溶液；样品S3为26%的明胶溶液与4%的戊二醛溶液；样品S4为含16%尿素的26%的明胶溶液与8%的戊二醛溶液；样品S5为比例为7：1的混合蛋白质溶液(45%的HSA与26%的明胶组成,下同)与8%的戊二醛溶液；样品S6为比例为6：2的混合蛋白质溶液与6%的戊二醛溶液；样品S7为比例为5：3的混合蛋白质溶液与5%的戊二醛溶液。2筛选出的软组织粘合剂体外理化性能的测定参照YY/T0729《组织粘合剂粘接性能试验方法》及前人研究基础,将粘合剂粘接于刮去脂肪层的猪皮条块一端,利用电脑式单柱拉力试验机进行粘合强度的测定。将中间带有一个针孔的猪小肠黏膜固定于压力测试机上,涂抹软组织粘合剂形成一个密封的薄膜,通过测定使薄膜针孔处破裂的最大压力来判定粘合剂的密封效果。家兔心脏取血后抗凝,并用其进行各组粘合剂对兔血的溶血性考察。结果表明,S2、S3、S5的伤口闭合强度与密封效果均与对照BioGlue无显著性差异,表明这三个样品的理化性能与BioGlue相似；而S4、S6、S7的理化性能则弱于BioGlue。溶血率实验则表明,所有的实验组及对照组粘合剂均不表现溶血性。3各种软组织粘合剂浸提液对小鼠成纤维细胞L929的体外毒性评价参照GB/T16886《医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品》中的规定,对各种软组织粘合剂按照1g/5mL培养基的比例进行2倍于规定浓度的浸提,37℃浸提24h。通过预实验与前人研究,采用每孔7000个细胞的密度接种于96孔细胞培养板上,于给药48h后进行MTT检测；采用每孔2×106个细胞的密度接种于6孔细胞培养板上,于给药24h后进行细胞周期检测。结果表明,S2、S6、S7对细胞增殖的抑制情况与对照组无显著性差异,表明这三个样品与BioGlue对细胞的毒性相当,而S3、S4、S5对细胞增殖的抑制情况与对照组存在显著性差异,其中S3、S5毒性较低,S4毒性较高。所有样品组与对照组均将细胞周期阻滞于G2期,表明样品组及对照组均对细胞存在一定的体外毒性,还需要通过动物体内实验进行系统性考察。4各种软组织粘合剂在大鼠及小鼠体内的生物学评价基于各种软组织粘合剂体外理化性能与细胞毒性的测定结果,继续对样品组与对照组粘合剂进行体内评价。具体参照GB/T14233《医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物试验方法》与GB/T16886《医疗器械生物学评价国家标准》,系统考察软组织粘合剂在Wistar大鼠体内的降解情况及生物相容性,以及浸提液对昆明小鼠的急性全身毒性。研究结果表明,所有含HSA的样品组S2、S5、S6、S7及含BSA的对照组S1的体内降解率均较低,考察12w后降解仍不到40%,但蛋白质成分单纯为明胶的样品S3、S4则表现出相对较高的降解率,12w后降解可达90%以上。HE染色结果表明,所有样品组及对照组炎症反应均逐渐降低,12w后几乎观察不到炎症反应的存在；VG染色结果表明,埋植一段时间后,所有组别的大鼠均有皮下纤维囊增生的情况出现,随着时间的延长,均表现为致密且囊壁变薄；急性全身毒性结果表明,所有样品组及对照组均无明显的急性全身毒性。本研究取得的主要研究成果有：(1)通过参考已上市产品BioGlue的配方及国内外关于医用粘合剂的研究,设计出几种基于HSA与明胶的医用软组织粘合剂,并通过测定其胶凝时间来筛选各种粘合剂中HSA、明胶及戊二醛的最适浓度及比例。(2)参照YY/T0729《组织粘合剂粘接性能试验方法》,利用电脑式单柱拉力试验机,测定各种软组织粘合剂在猪皮上的粘合强度；同时利用压力机测定各种粘合剂的密封效果。研究表明,S2、S3、S5的伤口闭合强度及密封性与对照BioGlue相比均无显著性差异,而S4、S6、S7的伤口闭合强度与密封性则与对照存在显著性差异,且均低于对照组。而溶血率实验则表明所有粘合剂均不会产生溶血现象。这提示我们S2、S3、S5可能会有比较好的体外及体内相容性与顺应性。(3)评价了各种软组织粘合剂对小鼠成纤维细胞L929的体外毒性,包括MTT法测定其对细胞增殖的抑制及流式细胞术测定浸提液对L929细胞周期的影响两部分。研究表明,S2、S6、S7对细胞增殖的抑制情况与对照组相比无显著性差异,表明这三个样品与BioGlue对细胞的毒性相当,而S3、S4、S5对细胞增殖的抑制情况与对照组相比则存在显著性差异,其中S3、S5毒性较低,S4毒性较高。流式结果则表明所有样品组与对照组均将细胞周期阻滞于G2期,表明所有粘合剂均对细胞存在一定程度的毒性作用。(4)对各种软组织粘合剂在Wistar大鼠及昆明小鼠的体内作用情况进行了考察。结果显示,对于体内降解而言,单纯含有明胶的样品S3、S4更优于对照S1,其他样品则与S1相当；对于体内生物相容性而言,在12w的考察期内,所有样品组大鼠均表现出与对照组类似的炎症变化及纤维囊增生变化过程；对于急性全身毒性而言,所有实验组与对照组小鼠体重均逐日增加,未见任何不良反应,可以初步认为各组粘合剂浸提液基本安全,对任何性别的小鼠均不存在急性全身毒性。结果表明,通过测定胶凝时间筛选出合适的组分及比例,进一步测定理化性能、体外毒性、体内性能,可以初步确定S2、S3、S5是有望替代BioGlue的新型医用软组织粘合剂。