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硫化氢是继一氧化氮和一氧化碳之后的第三种气体信号分子。研究表明,硫化氢具有重要的生物学功能,参与体内多个病理生理过程的调节。在中枢神经系统,硫化氢发挥神经调质样作用,能够调节NMDA受体介导的神经传导,易化长时程增强效应形成。但是,硫化氢是否影响神经再生,这方面的研究报道较少。因此,本研究主要探讨硫化氢是否影响小鼠 SVZ区神经干细胞的增殖与分化及其信号机制,为揭示硫化氢的神经生物学功能提供实验依据。 目的:研究硫化氢对小鼠SVZ区神经干细胞增殖及分化的影响,并探讨相关的分子机制。 方法:(1)分离C57BL小鼠胚胎(E13-14)SVZ区神经干细胞进行体外培养,悬浮培养的神经球传代贴壁培养2次后用于实验;干细胞表面标记物nestin及Sox2免疫荧光共染鉴定神经干细胞。(2)免疫荧光结合western blot及反转录PCR的方法鉴定胚胎神经干细胞内硫化氢内源性合成酶胱硫醚-β-合成酶(cystathionineβ-synthase, CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionineγ-lyase, CSE)的表达,Q-PCR测定CBS与CSE mRNA的相对含量;免疫荧光方法鉴定成年C57BL小鼠SVZ区及胎鼠E14脑组织切片中CBS、CSE及nestin的表达;(3)神经球计数法检测硫化氢供体(NaHS及缓释剂GYY4137)作用后神经干细胞的自我更新;Brdu免疫荧光染色法检测神经干细胞的增殖;免疫荧光方法标记神经元标记物Tuj-1与星形胶质细胞标记物GFAP,检测硫化氢供体作用后神经干细胞的分化;MTT方法检测神经干细胞的存活率;Caspase-3免疫荧光染色检测神经干细胞凋亡;反转录PCR检测胶质源性神经营养因子mRNA水平的影响;采用western blot测定CREB的磷酸化水平。 结果:(1)免疫荧光方法标记约99％的体外培养细胞表达干细胞表面标记物nestin及Sox2,说明成功分离培养纯度较高的胚胎神经干细胞,可以用于本研究。(2)免疫荧光法检测显示,在成年C57BL小鼠SVZ区、胎鼠E14脑组织切片及体外培养的神经干细胞内CBS均有较高含量的表达,RT-PCR及western blot进一步验证了CBS的表达;免疫荧光方法、PCR及western blot检测到胎鼠E14脑组织切片及体外培养的神经干细胞内CSE的表达,但在成年的C57BL小鼠SVZ区未检测到CSE的阳性表达;Q-PCR法提示体外培养的神经干细胞内CBS mRNA水平约是CSE的3倍。(3)神经球计数法及Brdu免疫荧光染色显示硫化氢供体可促进体外培养的神经干细胞的增殖。在体实验也表明硫化氢供体NaHS在一定剂量范围内,呈剂量依赖性地促进SVZ区神经干细胞增殖。体外分化实验显示硫化氢可促进神经干细胞向神经元的分化。MTT法显示,硫化氢供体NaHS对细胞活力没有影响。Caspase-3免疫荧光染色表明,外源性硫化氢不影响神经干细胞凋亡。此外,NaHS呈浓度依赖性的升高星形胶质细胞中胶质源性神经营养因子mRNA的表达。Western blot显示NaHS不改变神经干细胞内CREB的磷酸化水平。 结论:外源性硫化氢可促进胚胎和成年小鼠SVZ区神经干细胞的增殖,同时促进神经干细胞向神经元分化,而不影响细胞凋亡;硫化氢促进神经干细胞增殖可能与其升高胶质源性神经营养因子的表达有关。