论文部分内容阅读
IK通道是由钙离子和电压双向门控的钾离子通道,广泛分布在机体多种类型细胞中,如T淋巴细胞、B淋巴细胞、上皮细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞和肌细胞等。同时IK通道与细胞生理活动的调控密切相关,如细胞数目增殖、细胞迁徙、细胞凋亡焦亡以及基因控制的细胞程序性死亡等。目前研究发现IK通道与恶性肿瘤、气道重塑、心肌梗死、动脉粥样硬化、哮喘、肾纤维化、镰刀形红细胞病等多种疾病密切相关。海南捕鸟蛛毒素-I（HNTX-I）是从海南捕鸟蛛中分离得到的一种高丰度多肽,相对分子量为3608.1 Da,含有33个氨基酸残基,其序列为ECKGFGKSCVPGKNECCSGYACNSRDKWCKVLL。虽然HNTX-I是至今为止发现的第一个IK通道的多肽类激活剂,但其活性并不理想,而且HNTX-I毒素与IK通道的相互作用机制也并不清楚。为了解决上述问题,深入研究HNTX-I毒素与IK通道作用的分子机制,本实验合成HNTX-I及其11条突变体,分别为E1K、E1F、E1F-S18K、K3A、F5I、K7A、E15D、R25A、D26A、K27A、K30A。通过膜片钳实验验证发现,合成的HNTX-I的活性和天然的HNTX-I的活性一致,表明合成后复性的多肽与天然的HNTX-I的结构相同。在HNTX-I的一系列突变体中,K3A、F5I和K7A在40μM浓度下对IK通道无明显的激活作用,E1F、E1F-S18K和E1K对IK通道的激活率在40μM浓度下均高于HNTX-I的激活率。E1F对IK通道的活性最高,4μM的E1F激活率为20.1%±0.4%,40μM的E1F激活率为78.5%±0.5%,80μM的E1F激活率为112.5%±0.7%,经Boltzmann sigmoidal方程拟合E1F对IK通道激活的EC50为8.01μM。上述结果表明,HNTX-I上的第1、3、5、7位氨基酸残基可能是毒素结合IK通道的关键位点,毒素主要利用N端氨基酸作用于IK通道。选取活性最高的HNTX-I突变体E1F研究HNTX-I与IK通道的结合机制。首先加入80μM的E1F后IK电流被显著激活,再加入100nM NS309继续能够激活IK通道电流大约1.25倍,加入1μM的TRAM-34能显著抑制IK被激活的电流。为了进一步探讨毒素与通道之间作用的结合机制,利用定点突变的方法对IK通道S1-S2、S3-S4、S5-S6的胞外区域进行丙氨酸扫描,构建了一系列IK通道突变体。在40μM浓度下,E1F对IK通道突变体W141A和T260A无明显的激活作用,但是对G259A的激活程度明显增强,说明这三个位点区域是毒素与通道作用的关键位置。S5-S6区域的Q229、V231、N232、T234、S238等突变后也显著的降低了和HNTX-I的亲和力。靠近S6的G259突变后可能由于疏水性减弱使E1F对IK通道的亲和力明显增强,相反T260突变后可能由于极性增强使相互作用力减弱。以上结果表明,HNTX-I毒素与IK通道相互作用可能是疏水作用的结果。