第一部分伴黄斑水肿的糖尿病性视网膜病变中Th17细胞相关的基因生物标志物:综合生物信息学分析和体内验证背景:既往研究表明,增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）玻璃体内T辅助细胞17（Th17）相关细胞因子显著升高,提示Th17细胞在糖尿病性视网膜病变（DR）的炎症反应中发挥重要作用,但其在DR,特别是糖尿病性黄斑水肿（DME）视网膜中的细胞浸润与相关性基因研究尚未见报道,本研究的目的是探索和挖掘伴有黄斑水肿的DR免疫细胞中的Th17细胞相关基因。方法:从Gene Expression Omnibus（GEO）数据库下载数据集GSE160306,其中包含9个NPDR样本和10个DME样本。使用Immu Cell AI算法来估计24种浸润免疫细胞中Th17细胞的丰度。通过差异分析和相关分析记录NPDR和DME之间差异表达的Th17相关基因（DETh17RGs）。通过基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析等聚合分析,构建了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络来分析DETh17RGs的潜在功能。运用Cyto Hubba插件算法、Lasso回归分析和支持向量机递归特征消除（SVM-RFE）以全面识别Hub DETh17RGs。Hub DETh17RGs的表达模式在其他几个与DR相关的独立数据集中得到进一步验证。Th17RG评分指的是使用GSVA样本评分方法对6个Hub DETh17RG进行遗传表征评分,用于区分早期和晚期糖尿病肾病（DN）以及正常肾和糖尿病肾病。最后,运用实时定量PCR（q PCR）验证Hub DETh17RGs在STZ诱导的DR模型小鼠（C57BL/6J）中的转录水平。结果:生物信息学分析方面,共鉴定出238个DETh17RGs,其中212个基因呈正相关,只有26个基因为负相关。六个基因（CD44、CDC42、TIMP1、BMP7、RHOC、FLT1）被鉴定为Hub DETh17RGs。由于DR和DN在临床实践中被发现具有很强的相关性,多个与DR和DN相关的独立数据集的验证证明Hub DETh17RGs不仅可以区分PDR患者和正常人,还可以区分DN患者和正常人。它还可以识别两种疾病的初期和晚期（NPDR与DME、早期DN与晚期DN）。湿试验验证方面,除CDC42和TIMP1外,其他Hub DETh17RGs在STZ诱导的DR模型小鼠中的q PCR转录水平和趋势与本研究中的人类转录组水平一致。结论:本研究揭示了与Th17细胞相关枢纽基因CD44、CDC42、TIMP1、BMP7、RHOC、FLT1可能参与了DR和DME发生发展分子机制过程,同时生物信息学分析提示这些枢纽基因可能参与了糖尿病在眼和肾并发症的串扰机制。第二部分伴黄斑水肿的糖尿病性视网膜病变中Th17细胞相关枢纽基因TIMP-1的表达与功能研究目的:对符合入组标准的PDR患者的玻璃体及纤维血管增殖膜中的TIMP-1表达量进行定量分析,研究TIMP-1表达量在玻璃体及纤维血管增殖膜之间相关性以及TIMP-1与临床基线特征的相关性,之后进一步研究TIMP-1在高糖状态下沉默TIMP-1前后其在人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）的相关蛋白表达水平及其表型的变化,为DR微血管病变发病机制提供新的认识。方法:体内实验方面,本研究共纳入PDR患者共24例24只眼作为实验组,特发性黄斑前膜（Epiretinal Membrane,ERM）患者共16例16只眼作为对照组,均进行了标准经睫状体平坦部25G玻璃体切割术。记录并保存术前患者的临床基线资料,术中取出玻璃体及膜组织（PDR为纤维血管增殖膜,ERM为黄斑前膜）后立即送检,完善玻璃体酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA）实验及膜组织的蛋白质免疫印迹（Western Blot,WB）实验定量及半定量检测TIMP-1的表达水平,先将玻璃体与膜组织中的TIMP-1表达量进行相关性分析,后将PDR组玻璃体和纤维血管增殖膜中的TIMP-1表达量分别与临床基线特征进行相关性分析,以期找出两种组织TIMP-1的关联性及PDR中TIMP-1与临床特征的关联性。体外实验方面,本研究通过单细胞RNA测序数据绘制了人视网膜、RPE、脉络膜组织中的TIMP-1表达图,进一步研究了TIMP-1在各种细胞的表达情况。确认了TIMP-1在HRMECs中的表达情况后,将HRMECs按处理方式不同分为四组:正常对照组,高糖组,高糖+si NC组,高糖+si TIMP-1组,完善CCK-8实验、Ed U实验、Ki-67实验、Transwell实验、划痕实验、管腔成形实验。检测Wnt通路相关蛋白、凋亡相关蛋白、管腔成形相关蛋白表达情况。结果:PDR组玻璃体及膜组织中的TIMP-1表达量均显著高于ERM组。ERM组TIMP-1在玻璃体与黄斑前膜中表达呈低度正相关,PDR组TIMP-1在玻璃体与纤维血管增殖膜中表达呈显著中度正相关。PDR组玻璃体和纤维血管增殖膜中的TIMP-1表达量均与血清总胆固醇、甘油三酯呈显著中度正相关。PDR组纤维血管增殖膜中的TIMP-1表达量与血清低密度脂蛋白呈显著低度正相关,玻璃体中的TIMP-1表达量与身体质量指数、血压的舒张压呈显著低度正相关。在CCK-8实验、Ed U实验、Ki-67实验、Transwell实验、划痕实验、管腔成形实验,Wnt通路相关蛋白、凋亡相关蛋白中的Cleaved caspase-3和Bax、管腔成形相关蛋白的免疫印迹实验中,与对照组相比,高糖组、高糖+si NC组、高糖+si TIMP-1组HRMECs的定量检测数值均显著升高。高糖组、高糖+si NC组HRMECs的定量检测数值均无明显差异。高糖+si TIMP-1组分别与高糖组、高糖+si NC组相比,HRMECs的定量检测数值均显著升高。而在凋亡相关蛋白Bcl-2的免疫印迹实验结果则呈现与以上实验定量检测数值完全相反的趋势。结论:TIMP-1可能是PDR玻璃体-纤维血管增殖膜形成机制中的关键分子,且与血清中的血脂相关指标呈正相关。在高糖状态下沉默TIMP-1可能促进HRMECs的增殖、迁移、凋亡、管腔成形,同时促进Wnt通路的激活。因此,TIMP-1可能是PDR靶向治疗的一个很有前途的治疗策略。第三部分伴黄斑水肿的糖尿病性视网膜病变中CD8+T细胞相关基因生物标志物背景:CD8+T淋巴细胞在组织的各个部位都有很强的促炎作用,一些研究表明,它在玻璃体中的浓度明显增加,表明CD8+T细胞在糖尿病视网膜病变（DR）的炎症反应中起着关键作用。然而,CD8+T细胞在DR视网膜中的浸润,特别是在糖尿病黄斑水肿（DME）中的浸润,以及其相关基因仍不清楚,本研究的目的是探索和挖掘伴有黄斑水肿的DR免疫细胞中的CD8+T细胞相关基因。方法:从基因表达总览（GEO）数据库下载GSE16036数据集。执行Immu Cell AI程序以评估包括CD8+T细胞在内的24种免疫细胞的丰度。通过差异分析和相关性分析获取非增殖性糖尿病视网膜病变（NPDR）和DME之间的CD8+T细胞相关基因（DECD8+TRGs）。实施富集分析和蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络作图以探索DECD8+TRG的潜在功能。通过Lasso回归、支持向量机递归特征消除（SVM-RFE）、Cytoscape软件中的Cyto Hubba插件和MCODE插件,以及加权基因共表达网络分析（WGCNA）来全面分析并获取Hub DECD8+TRGs。在其他两个与DR相关的独立数据集中进一步验证了Hub DECD8+TRGs的表达模式。CD8+TRG评分是指使用GSVA样本评分方法对Hub DECD8+TRGs的遗传特征进行分析,该评分可被用于区分早期和晚期糖尿病肾病（DN）以及正常肾和DN。最后,通过实时定量PCR（q PCR）验证DR模型小鼠中DECD8+TRGs的转录水平。结果:生物信息学分析方面,共鉴定出371个DECD8+TRGs,其中正相关基因294个,负相关基因仅77个。八个基因（IKZF1、PTPRC、ITGB2、ITGAX、TLR7、LYN、CD74、SPI1）被识别为Hub DECD8+TRGs。DR和DN具有很强的临床相关性,已被多个独立的数据集证明与CD8+T细胞相关的Hub基因有关。Hub DECD8+TRGs不仅可以区分PDR与正常视网膜和DN与正常肾,而且在两种疾病的早期和进展阶段（NPDR与DME,早期DN与进展期DN）中发挥作用。湿试验验证方面,STZ诱导的DR小鼠模型中Hub DECD8+TRGs的q PCR转录水平和趋势与人类转录组水平一致。结论:本研究揭示了与CD8+T细胞相关枢纽基因IKZF1、PTPRC、ITGB2、ITGAX、TLR7、LYN、CD74、SPI1可能参与了DR和DME发生发展分子机制过程,同时生物信息学分析提示这些枢纽基因可能参与了糖尿病在眼和肾并发症的串扰机制。