【摘 要】
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巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统由于具有高表达、高稳定和高分泌等特征,越来越广泛地被应用于各种外源蛋白表达及目的蛋白功能研究。但某些外源蛋白在分泌表达过程中,易受酵母内源性蛋白酶作用而发生降解,导致目的蛋白结构不完整、表达量降低,并影响后续的分离纯化和回收。YPS2（yeast aspartic protease 2）蛋白酶是一种天冬氨酸蛋白酶,它能特异性地切割底物中单或双
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巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统由于具有高表达、高稳定和高分泌等特征,越来越广泛地被应用于各种外源蛋白表达及目的蛋白功能研究。但某些外源蛋白在分泌表达过程中,易受酵母内源性蛋白酶作用而发生降解,导致目的蛋白结构不完整、表达量降低,并影响后续的分离纯化和回收。YPS2（yeast aspartic protease 2）蛋白酶是一种天冬氨酸蛋白酶,它能特异性地切割底物中单或双碱性氨基酸残基位点,起着加工前肽的作用。而我们的研究表明毕赤酵母表达外源蛋白时出现的降解多发生在碱性残基位点,因此我们推测这可能与yapsin蛋白酶家族有关。并且,本实验室通过敲除毕赤酵母YPS1基因,明显改善了野生GS115表达HSA-AX15（R13K）时出现的降解,但我们用此YPS1基因缺陷菌株表达另一种融合蛋白HSA-IFN-α2b,发现降解并没有得到明显改善,因此本研究拟进一步构建毕赤酵母YPS2基因缺陷菌株,以期解决毕赤酵母表达某些外源蛋白时出现的降解问题。本研究首先通过CODEHOP PCR、反向PCR和TAIL-PCR技术分离克隆得到毕赤酵母YPS2基因,然后构建打靶质粒转化毕赤酵母GS115野生菌株,经基因同源重组得到YPS2缺陷菌株,再利用报告蛋白HSA-IFN-α2b和HSA-AX15（R13K）分别进行诱导表达,以及抽提缺陷菌株的不可溶蛋白与HSA共孵育,对YPS2缺陷菌株进行评价。结果显示,缺失YPS2的GS115菌株表达HSA-IFN-α2b时仍然出现降解,并与野生GS115表达HSA-IFN-α2b时出现的降解基本一致;而用其表达HSA-AX15,降解得到轻微改善;抽提缺陷菌株和野生GS115菌株的不可溶蛋白分别与HSA共孵育,在pH6.0的条件下,两者使HSA降解产生的谱带基本一致,并且都只发生了少量降解,在pH4.0的条件下,两者的降解谱带却有很大的差别,野生GS115的不可溶蛋白几乎使HSA发生了彻底地降解,而YPS2缺陷菌株的不可溶蛋白只使HSA发生了部分降解,并且从谱带上看,明显减少了几条降解带。这表明YPS2蛋白酶在pH6.0条件下,几乎没有活性;而在pH4.0条件下,具有较强的活性。
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