本文着重于蛋白质复合体分离鉴定新技术——串联亲和纯化技术体系在本实验室的建立及应用研究。在对细胞中过表达诱饵蛋白成功进行分离纯化鉴定的基础上,建立了更适合通量化和接近细胞生理状态的低表达策略,即通过逆转录病毒介导的基因转移,将带有亲和标签的基因稳定整合到细胞基因组内,在生理状态下分离纯化诱饵蛋白质的相互作用蛋白。蛋白质表达量的降低,需要更多的细胞初始用量来弥补染色方法和质谱鉴定灵敏度的不足。经过摸索,我们使用细胞工厂解决了细胞大规模培养的问题。最终确定进行诱饵相互作用蛋白质的分离纯化和鉴定的策略为:样品和对照串联亲和纯化—＞聚丙烯酰胺凝胶分离—＞考马斯亮蓝染色—＞切取差异条带—＞线性离子阱鉴定。结节性硬化症（Tuberous sclerosis complex,TSC）表现为脑、肺、肾等多个组织的良性肿瘤,由TSC1或TSC2编码的基因突变引起。但TSC蛋白的功能与作用机制尚不清楚。本文以TSC1为研究对象,按照上述策略,用1×109的细胞作为初始用量完成了TSC1蛋白质复合体的串联亲和纯化及质谱鉴定。在严格的纯化和鉴定条件下得到了150种蛋白质成分,其中包括已知相互作用蛋白质TSC2和DOCK7,表明我们能够运用串联亲和纯化技术进行有效的蛋白质复合体分离纯化。在得到质谱鉴定结果后,我们首先采取了生物信息学方法对相互作用的可靠性进行评价,并采用生物化学方法对相互作用进行了验证。生物信息学方法为本实验室开发的相互作用评估软件Picasso,分析结果表明阳性率为37%。生物化学方法为免疫共沉淀,随机选取的6个可能相互作用蛋白质,经过验证均表现为阳性。同时与已发表基因芯片结果进行比较,并对蛋白质定位进行分析,也均提示TSC1复合体研究结果具有较高的可信度。随后我们对TSC1相互作用蛋白质的结构域特征和与人类疾病的关联关系进行了深入分析和讨论。发现含卷曲螺旋的蛋白质被富集了2.7倍,这些蛋白质可能与TSC1直接相互作用;约10%的蛋白质与神经疾病相关,这批蛋白质可能与TSC1一起维持大脑的正常发育和功能,如RBBP4可能与TSC1一起参与DNA修复的调控。综上所述,本研究采取串联亲和纯化技术在接近生理状况下研究抑癌基因TSC1的相互作用蛋白质,本研究成果揭示了TSC1复合体的复杂性,发现了许多潜在的TSC1的相互作用分子,为进一步研究TSC复合体的生物学功能和分子机制提供了新的方向。