虫媒病毒又称节肢动物病毒,是指能在敏感的节肢动物,如蚊、蜱、白蛉、蠓等吸血昆虫体内繁殖但不致病,通过吸血昆虫叮咬而在人畜间传播的一组病毒。国际上已发现的虫媒病毒约537种,其中130余种可引起人畜疾病,表现为发热、皮疹、出血热甚至病毒性脑炎等。在人类历史上虫媒病毒曾经使成千上万的人畜患病或死亡,造成巨大的经济损失。目前,虫媒病毒仍然在各国甚至在世界范围造成严重传染病的流行。我国幅员辽阔,地理景观复杂,媒介生物众多,存在多种虫媒病毒。目前已证实乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、新疆出血热病毒、登革热病毒等四种虫媒病毒在我国存在与流行。此外,随着国际交往的日益频繁,境外虫媒病毒病传入我国的可能性也显著增加,因此,早期、快速、准确地检测虫媒病毒的感染具有重要的意义。悬浮芯片是近年来新兴的一种可对多指标同时进行定性、定量分析的新型芯片技术,它创新性地将细胞大小的微球作为检测探针的载体,并悬浮于液相之中,为生物反应提供了极佳的反应环境,有利于核酸和蛋白质保持天然构象,具有高通量、操作简便、重复性好、灵敏度高、信噪比好、灵活性大等优点。本研究以登革热病毒、乙型脑炎病毒、西尼罗病毒、森林脑炎病毒、黄热病病毒等5种黄病毒属的虫媒病毒为研究对象,设计针对以上病毒的通用扩增引物和特异检测探针,再结合悬浮芯片技术,以建立能快速甄别以上5种病毒并对登革热病毒进行基因分型的悬浮芯片检测方法,为虫媒病毒的检测与鉴定提供一种新的方法。首先,从Genebank中收集以上五种虫媒病毒的全部基因组序列。接着,利用Clustal X 1.83和DNAMAN 6.0软件对病毒基因组序列进行属间、种间和型间比对,并参考相关文献,在黄病毒属NS5区设计一对通用扩增引物,用于5种病毒的RT-PCR扩增。进而,在靶核酸扩增区内设计八条特异性检测探针,用于五种虫媒病毒的检测和登革热病毒的基因分型。引物和探针均适当进行简并设计,以尽量覆盖病毒所有的分离株。通用引物扩增的目的序列为266 bp;寡核苷酸探针的长度均为20 nt,Tm值介于52±5℃。将设计好的引物和探针进行Blast分析,验证其种属特异性,然后将探针共价交联到不同的色标微球上,以制备悬浮芯片。进而,在对悬浮芯片的检测条件进行优化的基础上,进一步对所建立方法的检测重复性、特异性和灵敏度进行验证。最后,对模拟混合标本及本实验室以往采集和保存的55份标本进行检测,并和特异RT-PCR检测方法进行平行比较。八种（型）黄病毒经敏感细胞增殖培养后,用所设计的通用引物进行逆转录扩增,琼脂糖凝胶电泳显示不但均扩增出了目的条带,而且条带清晰、明亮、单一,表明所设计的通用引物能对以上病毒进行有效扩增。通过一系列的预实验,对悬浮芯片的检测条件进行了摸索和优化,将其杂交条件确定为52℃反应1530min。在此条件下,利用本方法对该八种（型）病毒进行多批次的检测,不但能够准确鉴定病毒种类并对登革热病毒准确分型,而且批次间的检测荧光强度值的变异系数（CV）均在8%以内,表明本方法具有很好的可重复性和稳定性。通过同时检测流感病毒、狂犬病毒、基孔肯雅病毒、辛德毕斯病毒和圣路易斯脑炎病毒等无关病毒和乙型脑炎病毒、西尼罗病毒和登革热病毒等可检病毒,对其检测特异性进行验证。结果显示,本方法能对目的病毒进行有效甄别,没有任何的假阳性结果和明显的非特异信号,表明本方法有着很好的检测特异性。最后,以JEV、WNV和YF为例,在空斑滴定病毒的基础上,对本方法的检测灵敏度进行了确证,结果显示本法对JEV和YF的检测灵敏度可达1.4个PFU,而WNV的可达14个PFU,表明本方法的检测灵敏度较高,有应用于临床检测的良好前景。将登革热病毒14型的RNA分别两两混合,模拟混合感染标本,用所建立的方法均可对这六种组合进行准确鉴定,而且没有明显的非特异信号,表明它可用于混合标本的检测。另外,对本室以前采集并保存的多种标本共55份,用本法进行检测,和特异RT-PCR检测方法的结果相比,本法的检测准确度可达98.2%,而特异度为100%。通过Kappa检验（即一致性检验）,得出χ2= 0 <χ2（1）0.05 =3.841,所以P>0.05,表明悬浮芯片方法和特异RT-PCR的检测结果之间的差别无统计学意义,可以认为悬浮芯片方法的检测结果是可信的。将通用引物RT-PCR扩增技术、核酸分子杂交技术和悬浮芯片技术有机结合在一起,建立了能同时检测登革热病毒、乙型脑炎病毒、西尼罗病毒、森林脑炎病毒和黄热病病毒等5种虫媒病毒,并能对登革热病毒14型进行分型的悬浮芯片检测方法。经实验验证,本方法有着良好的检测重复性、特异性和灵敏度,不但可以用于单一病毒样本的检测,而且还可应用于混合样本的检测。经统计学分析,本法和种特异的RT-PCR检测方法相比,有着很好的一致性,但是它在未知标本的快速、高通量检测中有着巨大的优势。本研究在国内外率先将悬浮芯片技术应用于以上虫媒病毒核酸的检测,不但能够早期检测虫媒病毒感染,而且整个实验操作过程简便、快速。为在媒介及人和动物标本中进行以上八种（型）病原体筛查和流行病学本底调查提供技术手段,在传染病的流行病学调查、临床诊断、疾病预防控制及防生反恐中病原体检测等方面都具有重要意义。