胃癌是世界范围内第二大常见的癌症,每年新增病例约90万。尽管过去的几十年中,胃癌的发病率和死亡率在全球大部分地区已显著下降,但是晚期胃癌病情的控制仍十分困难。赫赛汀(Herceptin)是靶向人类表皮生长因子受体2(HER2)的治疗性单克隆抗体,现为HER2阳性乳腺癌标准化治疗的一线用药。对于HER2阳性的晚期胃癌患者,赫赛汀与化疗联用亦有效。根据国际III期赫赛汀临床试验结果,胃癌患者的反应率、中位无进展生存期、中位总生存期均显示临床和统计学获益。目前,赫赛汀已被批准用于HER2阳性晚期胃癌患者的临床治疗。然而,赫赛汀耐药是乳腺癌和胃癌治疗中普遍存在的问题。HER2阳性胃癌患者约占25%,而患者对赫赛汀的反应率仅为12.8%,远低于在乳腺癌中的报道。已知的赫赛汀耐药机制主要来自乳腺癌研究的发现,包括PI3K信号通路过度活化、PTEN(磷酸酶和张力酶同源物)缺失、PI3K的催化亚基PIK3CA突变。然而,有关胃癌的赫赛汀原发性和获得性耐药机制鲜有报道。本研究中,我们通过对胃癌细胞进行梯度加压诱导,建立了赫赛汀耐药的胃癌细胞株NCI-N87-R和MKN-45-R。细胞增殖活性分析结果表明,NCI-N87-R和MKN-45-R细胞已获得显著的赫赛汀抗性。光学显微镜下可观察到,耐药细胞的形态发生了明显的改变,Western blot和免疫荧光标记研究发现,耐药细胞中上皮标志性蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)、紧密连接蛋白-1(ZO-1)的表达明显下调,而间质标志性蛋白波形蛋白(Vimentin)的表达则明显升高,上皮-间质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)的重要调控分子ZEB1、Slug、Snail的表达亦上调,提示耐药细胞发生了EMT。进一步通过细胞迁移实验、三维培养、失巢凋亡、软琼脂集落形成、裸鼠体内成瘤等实验,证实耐药胃癌细胞的迁移能力、侵袭性、转移能力和致瘤原性均显著增强,表明赫赛汀长期处理导致胃癌细胞产生了药物抗性及获得了恶性表型。EMT可赋予肿瘤干细胞(Cancer Stem Cell,CSC)的特性,如自我更新、分化、对放化疗耐药等。有研究表明,CD44+的胃癌细胞具有CSC样特征。我们对NCI-N87-R细胞进行了实时定量RT-PCR和流式细胞分析,发现NCI-N87-R细胞中CD44蛋白和m RNA水平均显著升高。细胞微球形成实验结果表明,NCI-N87-R细胞的自我更新能力显著增强。此外,NCI-N87-R细胞中其它干细胞相关蛋白(CD133和OCT-4)的表达亦明显升高。在MKN-45-R细胞中获得了相同的结果。动物实验研究结果证实,NCI-N87-R细胞的致瘤原性显著增强,接种5×103个即可在动物体内成瘤,提示赫赛汀耐药的胃癌细胞已获得了CSC样表型。为了阐明胃癌细胞赫赛汀耐药的分子机制,我们检测了赫赛汀耐药的胃癌细胞中HER2介导的几个重要生存信号通路(AKT、ERK和STAT3)的活化。在母本细胞中,HER2下游的ERK及AKT呈明显活化,而STAT3的磷酸化水平较低。然而,在NCI-N87-R细胞中,AKT的活化几乎被完全抑制,而STAT3呈异常活化。双荧光素酶报告基因分析结果显示,NCI-N87-R细胞中STAT3的活性明显增强。应用WP1066阻断Jak2/STAT3信号,可显著抑制耐药细胞的增殖,并恢复耐药细胞对赫赛汀的敏感性。这些研究结果提示,母本细胞赖以生存的信号在耐药过程中发生了明显偏转,STAT3信号异常活化在胃癌细胞赫赛汀耐药中发挥关键的作用。STAT3信号通路活化与多种肿瘤的发生、转化、侵袭和转移密切相关。炎性细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6等可直接或间接激活STAT3信号,诱导肿瘤细胞发生EMT和CSC转化。通过实时定量RT-PCR和ELISA分析,我们发现NCI-N87-R细胞中IL-6 m RNA的表达水平增加了上百倍。在母本细胞中,IL-6的分泌在检测限以下,而在耐药细胞中,IL-6的分泌则高达7000 pg/m L。IL-6刺激可诱导NCI-N87和NCI-N87-R细胞中STAT3磷酸化,并可明显拮抗赫赛汀对NCI-N87细胞的增殖抑制作用;抑制STAT3信号可增强NCI-N87-R细胞对赫赛汀的敏感性,促进耐药细胞凋亡,提示IL-6大量分泌导致STAT3持续活化可能是胃癌细胞对赫赛汀产生抗性的重要原因。近年来,Notch信号通路在肿瘤发生发展中的重要性逐渐被研究者所认识。在乳腺癌细胞中,IL-6是Notch信号通路的靶基因,而Notch活化可促进IL-6表达。为了探索导致赫赛汀耐药细胞中IL-6表达上调的原因,我们观察了Notch信号在赫赛汀耐药的胃癌细胞中是否发生了变化。实时定量RT-PCR及启动子活性分析结果显示,耐药细胞中Notch蛋白的表达及转录激活活性均明显增强。应用γ分泌酶抑制剂抑制Notch胞内信号活化可显著降低IL-6 m RNA的表达,表明耐药细胞中IL-6过表达与Notch活化有关。Western blot分析结果表明,IL-6刺激可上调NCI-N87细胞中Notch配体Jagged-1表达,而STAT3抑制剂则可阻断这一效应,提示在NCI-N87细胞中存在IL-6/STAT3/Jagged-1信号轴。我们还发现,在NCI-N87细胞中过表达Jagged-1可上调IL-6及Notch的靶基因HEY1、HEY2表达,证实胃癌细胞中IL-6是Notch下游的靶基因,Jagged-1、Notch、IL-6在耐药的胃癌细胞中构成正反馈环路,抑制Notch信号可增强耐药细胞对赫赛汀的敏感性。此外,在细胞三维培养和微球形成实验中,同时阻断STAT3和Notch信号可显著抑制耐药细胞的侵袭表型及CSC样特性。以上结果证实,IL-6/STAT3/Jagged-1/Notch正反馈信号通路在胃癌细胞赫赛汀耐药过程中发挥关键的作用。综上所述,我们的研究结果揭示:(1)赫赛汀长期处理可诱导胃癌细胞产生抗性。(2)IL-6/STAT3/Jagged-1/Notch信号轴活化可能是胃癌获得性赫赛汀耐药的一个重要机制。(3)联合阻断STAT3和Notch信号可能成为预防或延缓赫赛汀耐药的有效策略。本研究为提高赫赛汀在胃癌治疗中的疗效及逆转耐药提供了潜在的药物作用靶点。