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研究1PRDX2对结直肠癌细胞周期和自噬的影响及机制研究
目的：结直肠癌是世界范围内多发的恶性肿瘤。研究表明，在结直肠癌中PRDX2与增殖、细胞干性、化疗耐药等肿瘤功能有关。然而在结直肠癌中未见PRDX2与细胞周期和自噬的研究报道，且P38通路与PRDX2在结直肠癌中的关系尚不清楚。故本研究探讨PRDX2是否通过P38通路影响结直肠癌细胞周期和自噬作用。
方法：
1.利用TCGA数据库数据，调查PRDX2在多种肿瘤中的表达，以及在结肠癌、直肠癌中与肿瘤病理之间的关系。
2.分析GEO数据库数据(GSE81429)，该数据集收集了结直肠癌细胞系HT-29和SW480分别转染Control-siRNA和PRDX2-siRNA的高通量测序结果。将数据转换后与人类基因组对比，计数表达量。分析筛选差异表达基因，将差异表达基因进行富集分析后，使用KEGGpathway分析。
3.利用慢病毒系统转染sh-RNA载体，在HCT116和HT-29细胞中敲减PRDX2，筛选稳转株。CCK-8实验检测细胞增殖；用流式细胞仪检测细胞周期。WesternBlot检测周期相关蛋白P21、P27的蛋白表达。
4.在HCT116和HT-29细胞中，分别用免疫荧光方法染色阴性对照组(NC)和PRDX2敲低组(sh-PRDX2)LC3B蛋白，观察LC3蛋白聚集，了解自噬小体聚集形成。用Cherry-GPF-LC3质粒转染HCT116，通过红绿荧光，观察细胞内自噬状态。透射电镜观察NC组和sh-PRDX2组内自噬小体形成。WesternBlot检测自噬相关蛋白LC3B,SQSTM1/P62,Beclin1的表达。
5.用WesternBlot检测对照组(NC)和PRDX2敲低组(sh-PRDX2)MAPK通路相关蛋白，包括P38，ERK，JNK，以及p-P38，p-ERK和p-JNK。并用P38激动剂Dehydrocorydalinechloride(DHC)处理后，再次检测通路蛋白P38，p-P38；通路下游FoxO；周期蛋白P21以及自噬蛋白LC3的蛋白表达。
6.利用TCGA数据库结直肠癌患者样本数据，分析患者组织样本中PRDX2与细胞周期、自噬相关基因间的mRNA表达关系。
7.利用裸鼠皮下成瘤块，移植入裸鼠腹腔盲肠远端。4周后取下瘤子，WesternBlot检测瘤内周期蛋白P21，P27；自噬蛋白SQSTM1/P62，LC3B，Beclin1的表达。
结果：
1.在TCGA数据库中，PRDX2在结肠癌(COAD)、直肠癌中(READ)均表达量较高，且与其他肿瘤相比，在结直肠癌中PRDX2的差异表达更为明显。PRDX2在侵袭性乳腺癌(BRCA),肝胆管癌(CHOL),干细胞腺癌(LIHC),肺鳞癌(LUAD)，前列腺癌(PRAD)，子宫内膜癌(UCEC)中也有差异表达。PRDX2在结直肠癌患者的所有病理情况下均高表达。
2.在GEO数据库数集GSE81429中，找到173个基因均在HT-29和SW480细胞系转染PRDX2-siRNA后，显著差异表达。富集分析提示差异基因富集在核糖体(Ribosome)，FoxO信号传导等细胞功能。其中，FoxO信号通路提示，PRDX2可能通过P38MAPK/FOXO信号通路影响细胞周期进程和自噬流。
3.在结直肠癌细胞系的PRDX2敲低组中，细胞增殖被抑制。敲低PRDX2后细胞周期进程阻滞在S期。PRDX2敲低组中细胞周期抑制蛋白P21，P27表达增高。
4.与对照组(NC)相比，PRDX2敲低组(sh-PRDX2)中LC3B自噬小体荧光聚集斑点减少。结直肠癌细胞系PRDX2敲低组红绿蛋白中绿色荧光增多。PRDX2敲低组中SQSTM1/P62蛋白表达增高，LC3II/I蛋白比例降低，Beclin1蛋白表达降低。
5.在HCT116细胞中，与对照组(NC )相比，PRDX2敲低组(sh-PRDX2)P38通路关键分子p-P38的蛋白表达降低。在PRDX2敲低组和对照组中，使用P38激活剂Dehydrocorydalinechloride(DHC)处理后，与未处理组相比，通路蛋白p-P38、细胞周期P21蛋白、自噬LC3II/I蛋白比例均有所恢复。
6.在结直肠癌患者样本集的数据中，PRDX2的mRNA水平与周期基因CCNA2的mRNA水平相关(r=0.3367，p=2.759e-07)，CCNB1(r=0.3964，p=9.014e-10)，CDK1(r=0.405，p=3.6e-10)，CDK4(r=0.4098，p=2.116e-10)；也与自噬相关基因BECN1(r=-0.374，p=8.8846e-09)和ULK1(r=-0.3251，p=7.336e-07)水平相关。
7.在小鼠原位移植瘤模型中，PRDX2敲低后抑制了结直肠癌肿瘤的形成，并增加了细胞周期抑制蛋白P21，P27表达，自噬促进蛋白Belin1表达降低，自噬抑制蛋白SQSTM1/p62表达增高，LC3II/I蛋白比例降低。
结论：本研究结果提示，PRDX2可能通过激活p38MAPK通路而促进结直肠癌细胞周期进程及细胞自噬。
研究2.Sestrin2对结直肠癌细胞干性的影响及机制研究
目的：结直肠癌是中国常见的肿瘤之一。研究发现，Sestrin2在结直肠癌中可以抑制细胞迁移、侵袭。但是Sestrin2是否通过Wnt通路影响结直肠癌细胞干性尚未见报道。故本研究探讨Sestrin2是否通过Wnt通路影响结直肠癌细胞干性。
方法：
1.获取TCGA数据库，结肠癌及直肠癌Sestrin2表达数据，分别比较Sestrin2在结肠癌及直肠癌中的表达。
2.构建慢病毒载体，在结直肠癌细胞系HCT116和SW620中过表达Sestrin2，分别建立对照组(LV-GFP )和Sestrin2过表达组(LV-Sestrin2)，筛选稳定株。CCK-8实验检测细胞增殖，克隆实验检测克隆形成能力，划痕实验检测细胞迁移能力。
3.在对照组(LV-GFP)和Sestrin2过表达组(LV-Sestrin2)的结直肠癌细胞系HCT116，SW620细胞中，成球实验检测细胞成球能力，流式细胞术检测CD44阳性细胞比例，qPCR和Westernblot检测干性表型及干性转录因子，包括CD44，Oct4，Sox2和Cxcr4的表达。
4.Westernblot检测Wnt通路关键蛋白β-catenin和下游因子C-Myc蛋白表达。使用Wnt通路激活剂BML-284处理细胞，成球实验观察Wnt通路激活剂处理后的细胞成球能力，Westernblot检测BML-284处理后的干性表型蛋白CD44，Wnt通路关键蛋白β-catenin和下游因子C-Myc蛋白表达。
5.在小鼠异种移植瘤模型中，比较对照组和高表达组皮下成瘤的大小，并用Westernblot检测皮下移植瘤干性表型Sox2，Wnt通路关键蛋白β-catenin和下游因子C-Myc蛋白表达。
结果：
1.TCGA数据库中，在结肠癌及直肠癌患样本中Sestrin2的表达均较癌旁正常组织降低。
2.在结直肠癌细胞系HCT116和SW620中，与对照组(LV-GFP)相比，Sestrin2过表达组(LV-Sestrin2)增殖能力、克隆形成能力及迁移能力均减弱。
3.与对照组(LV-GFP)相比，Sestrin2过表达组(LV-Sestrin2)成球能力降低，CD44表达细胞比例降低。干性相关分子Sox2，Oct4，Cxcr4，CD44的蛋白及mRNA表达降低。
4.在Sestrin2过表达组中，Wnt通路关键蛋白β-catenin和下游因子C-Myc蛋白表达降低。Wnt通路激活剂BML-284处理细胞后成球能力部分恢复。干性表型蛋白CD44，Wnt通路关键蛋白β-catenin和下游因子C-Myc蛋白表达也有部分恢复。
5.在动物实验中，与HCT116-GFP细胞相比，HCT116-Sestrin2细胞皮下成瘤的瘤体显著减少，同时Sestrin2高表达组的Sox2，C-Myc，β-catenin蛋白表达降低。
结论：本实验结果提示Sestrin2可能通过下调Wnt通路，抑制了结直肠癌细胞的干性表达。
目的：结直肠癌是世界范围内多发的恶性肿瘤。研究表明，在结直肠癌中PRDX2与增殖、细胞干性、化疗耐药等肿瘤功能有关。然而在结直肠癌中未见PRDX2与细胞周期和自噬的研究报道，且P38通路与PRDX2在结直肠癌中的关系尚不清楚。故本研究探讨PRDX2是否通过P38通路影响结直肠癌细胞周期和自噬作用。
方法：
1.利用TCGA数据库数据，调查PRDX2在多种肿瘤中的表达，以及在结肠癌、直肠癌中与肿瘤病理之间的关系。
2.分析GEO数据库数据(GSE81429)，该数据集收集了结直肠癌细胞系HT-29和SW480分别转染Control-siRNA和PRDX2-siRNA的高通量测序结果。将数据转换后与人类基因组对比，计数表达量。分析筛选差异表达基因，将差异表达基因进行富集分析后，使用KEGGpathway分析。
3.利用慢病毒系统转染sh-RNA载体，在HCT116和HT-29细胞中敲减PRDX2，筛选稳转株。CCK-8实验检测细胞增殖；用流式细胞仪检测细胞周期。WesternBlot检测周期相关蛋白P21、P27的蛋白表达。
4.在HCT116和HT-29细胞中，分别用免疫荧光方法染色阴性对照组(NC)和PRDX2敲低组(sh-PRDX2)LC3B蛋白，观察LC3蛋白聚集，了解自噬小体聚集形成。用Cherry-GPF-LC3质粒转染HCT116，通过红绿荧光，观察细胞内自噬状态。透射电镜观察NC组和sh-PRDX2组内自噬小体形成。WesternBlot检测自噬相关蛋白LC3B,SQSTM1/P62,Beclin1的表达。
5.用WesternBlot检测对照组(NC)和PRDX2敲低组(sh-PRDX2)MAPK通路相关蛋白，包括P38，ERK，JNK，以及p-P38，p-ERK和p-JNK。并用P38激动剂Dehydrocorydalinechloride(DHC)处理后，再次检测通路蛋白P38，p-P38；通路下游FoxO；周期蛋白P21以及自噬蛋白LC3的蛋白表达。
6.利用TCGA数据库结直肠癌患者样本数据，分析患者组织样本中PRDX2与细胞周期、自噬相关基因间的mRNA表达关系。
7.利用裸鼠皮下成瘤块，移植入裸鼠腹腔盲肠远端。4周后取下瘤子，WesternBlot检测瘤内周期蛋白P21，P27；自噬蛋白SQSTM1/P62，LC3B，Beclin1的表达。
结果：
1.在TCGA数据库中，PRDX2在结肠癌(COAD)、直肠癌中(READ)均表达量较高，且与其他肿瘤相比，在结直肠癌中PRDX2的差异表达更为明显。PRDX2在侵袭性乳腺癌(BRCA),肝胆管癌(CHOL),干细胞腺癌(LIHC),肺鳞癌(LUAD)，前列腺癌(PRAD)，子宫内膜癌(UCEC)中也有差异表达。PRDX2在结直肠癌患者的所有病理情况下均高表达。
2.在GEO数据库数集GSE81429中，找到173个基因均在HT-29和SW480细胞系转染PRDX2-siRNA后，显著差异表达。富集分析提示差异基因富集在核糖体(Ribosome)，FoxO信号传导等细胞功能。其中，FoxO信号通路提示，PRDX2可能通过P38MAPK/FOXO信号通路影响细胞周期进程和自噬流。
3.在结直肠癌细胞系的PRDX2敲低组中，细胞增殖被抑制。敲低PRDX2后细胞周期进程阻滞在S期。PRDX2敲低组中细胞周期抑制蛋白P21，P27表达增高。
4.与对照组(NC)相比，PRDX2敲低组(sh-PRDX2)中LC3B自噬小体荧光聚集斑点减少。结直肠癌细胞系PRDX2敲低组红绿蛋白中绿色荧光增多。PRDX2敲低组中SQSTM1/P62蛋白表达增高，LC3II/I蛋白比例降低，Beclin1蛋白表达降低。
5.在HCT116细胞中，与对照组(NC )相比，PRDX2敲低组(sh-PRDX2)P38通路关键分子p-P38的蛋白表达降低。在PRDX2敲低组和对照组中，使用P38激活剂Dehydrocorydalinechloride(DHC)处理后，与未处理组相比，通路蛋白p-P38、细胞周期P21蛋白、自噬LC3II/I蛋白比例均有所恢复。
6.在结直肠癌患者样本集的数据中，PRDX2的mRNA水平与周期基因CCNA2的mRNA水平相关(r=0.3367，p=2.759e-07)，CCNB1(r=0.3964，p=9.014e-10)，CDK1(r=0.405，p=3.6e-10)，CDK4(r=0.4098，p=2.116e-10)；也与自噬相关基因BECN1(r=-0.374，p=8.8846e-09)和ULK1(r=-0.3251，p=7.336e-07)水平相关。
7.在小鼠原位移植瘤模型中，PRDX2敲低后抑制了结直肠癌肿瘤的形成，并增加了细胞周期抑制蛋白P21，P27表达，自噬促进蛋白Belin1表达降低，自噬抑制蛋白SQSTM1/p62表达增高，LC3II/I蛋白比例降低。
结论：本研究结果提示，PRDX2可能通过激活p38MAPK通路而促进结直肠癌细胞周期进程及细胞自噬。
研究2.Sestrin2对结直肠癌细胞干性的影响及机制研究
目的：结直肠癌是中国常见的肿瘤之一。研究发现，Sestrin2在结直肠癌中可以抑制细胞迁移、侵袭。但是Sestrin2是否通过Wnt通路影响结直肠癌细胞干性尚未见报道。故本研究探讨Sestrin2是否通过Wnt通路影响结直肠癌细胞干性。
方法：
1.获取TCGA数据库，结肠癌及直肠癌Sestrin2表达数据，分别比较Sestrin2在结肠癌及直肠癌中的表达。
2.构建慢病毒载体，在结直肠癌细胞系HCT116和SW620中过表达Sestrin2，分别建立对照组(LV-GFP )和Sestrin2过表达组(LV-Sestrin2)，筛选稳定株。CCK-8实验检测细胞增殖，克隆实验检测克隆形成能力，划痕实验检测细胞迁移能力。
3.在对照组(LV-GFP)和Sestrin2过表达组(LV-Sestrin2)的结直肠癌细胞系HCT116，SW620细胞中，成球实验检测细胞成球能力，流式细胞术检测CD44阳性细胞比例，qPCR和Westernblot检测干性表型及干性转录因子，包括CD44，Oct4，Sox2和Cxcr4的表达。
4.Westernblot检测Wnt通路关键蛋白β-catenin和下游因子C-Myc蛋白表达。使用Wnt通路激活剂BML-284处理细胞，成球实验观察Wnt通路激活剂处理后的细胞成球能力，Westernblot检测BML-284处理后的干性表型蛋白CD44，Wnt通路关键蛋白β-catenin和下游因子C-Myc蛋白表达。
5.在小鼠异种移植瘤模型中，比较对照组和高表达组皮下成瘤的大小，并用Westernblot检测皮下移植瘤干性表型Sox2，Wnt通路关键蛋白β-catenin和下游因子C-Myc蛋白表达。
结果：
1.TCGA数据库中，在结肠癌及直肠癌患样本中Sestrin2的表达均较癌旁正常组织降低。
2.在结直肠癌细胞系HCT116和SW620中，与对照组(LV-GFP)相比，Sestrin2过表达组(LV-Sestrin2)增殖能力、克隆形成能力及迁移能力均减弱。
3.与对照组(LV-GFP)相比，Sestrin2过表达组(LV-Sestrin2)成球能力降低，CD44表达细胞比例降低。干性相关分子Sox2，Oct4，Cxcr4，CD44的蛋白及mRNA表达降低。
4.在Sestrin2过表达组中，Wnt通路关键蛋白β-catenin和下游因子C-Myc蛋白表达降低。Wnt通路激活剂BML-284处理细胞后成球能力部分恢复。干性表型蛋白CD44，Wnt通路关键蛋白β-catenin和下游因子C-Myc蛋白表达也有部分恢复。
5.在动物实验中，与HCT116-GFP细胞相比，HCT116-Sestrin2细胞皮下成瘤的瘤体显著减少，同时Sestrin2高表达组的Sox2，C-Myc，β-catenin蛋白表达降低。
结论：本实验结果提示Sestrin2可能通过下调Wnt通路，抑制了结直肠癌细胞的干性表达。