本论文探索并建立了以电喷雾电离(ESI)、大气压化学电离(APCI)、大气压光致电离(APPI)三种电离方式相结合的“组合式”RRLC-MS/MS的新型分析方法,并结合多变量数据处理方法,开展了肺癌患者尿液的代谢组学研究。运用本方法共寻找到121个在肺癌患者与健康人尿液中存在显著性差异的内源性小分子代谢物。研究表明该方法适合于复杂生物体系的整体分析,能够最大程度地克服不同极性代谢物的离子化效率差异及离子歧视现象,并发挥不同离子化技术的特点,实现其优势互补,获得全面、完整的代谢物信息,为代谢组学研究提供了新思路。此外,本研究采用正、负离子检测模式的RRLC-ESIMS方法和多变量数据处理方法,开展了大批量健康者、肺癌初诊病例以及肺癌患者治疗前与治疗后的尿液样本的代谢组学研究。进一步验证和确认了前期小批量样本发现的可能生物标志物。同时,结合患者临床的疗效评价,考察可能生物标志物在健康状态、肺癌治疗前和治疗后三个阶段的变化趋势,寻找到了一些与疗效相关的生物标志物,有望为肺癌的临床疗效评价和预后判断提供重要依据。本论文的研究内容主要包括以下四个部分：1.组合式离子化方式的LC-MS分析方法研究本论文重点采用ESI、APCI、APPI三种电离技术相结合的多重离子化方式,开展了适合于代谢组学研究的“组合式”RRLC-MS分析方法研究。分别通过尿液中代表性代谢物标准品的离子化效率和检测尿液信息完整性两个角度,系统考察了本方法的离子化能力与适用性,建立了适合于尿液等复杂生物样本分析且可获得更全面代谢物信息的LC-MS分析方法。此外,对该分析方法进行了一系列方法学考察,结果表明,“组合式”离子化方法提高了RRLC-MS方法的整体灵敏度,且方法的精密度良好。因此,采用三种离子化技术相结合的RRLC-MS方法,有助于获得代谢组学研究所需求的全面、完整的代谢物信息。2.组合式离子化RRLC-MS方法在肺癌尿液代谢组学研究中的应用采用上述ESI、APCI、APPI三种电离技术相结合的“组合式”RRLC-MS/MS分析方法,结合多变量数据处理方法,开展了肺癌患者尿液的代谢组学研究,以寻找尿液中与肺癌相关的内源性小分子生物标志物。结果显示出“组合式”离子化方法的优势,在一定程度上克服了质谱检测存在的离子化效率差异和离子化歧视效应,避免单一离子化模式的LC-MS方法难以获取不同类型代谢物信息的局限性,尽可能满足了全面分析代谢物的需求。此外,该方法能够进一步验证不同离子化方法发现的可能生物标志物的可靠性。运用本方法共发现了121个代谢物在肺癌患者与健康人尿液中的含量存在显著性差异。上述发现的可能生物标志物与肺癌患者体内异常变化存在密切联系,极有可能成为新的肺癌生物标志物。目前,采用同位素丰度法、高分辨MS/MS谱及数据库检索等手段已鉴定出11个代谢物的结构,其中包括5个修饰核苷,5个氨基酸,1个吲哚衍生物。3.基于RRLC-MS方法的大批量肺癌患者与健康人尿液代谢组学研究本研究开展了大批量肺癌初诊病例与健康人尿液的RRLC-MS/MS分析,进一步对发现的可能生物标志物进行了验证与确认。目前,采用正、负离子检测模式的RRLC-ESIMS方法共获得66个可能生物标志物,其中21个与前期小样本获得的可能生物标志物一致,并运用上述同样方法已鉴定出5个可能生物标志物的结构,包括苯丙氨酸(Phenylalanine)、酪氨酸(Tyrosine)、色氨酸(Tryptophan)、脯氨酸二甲内盐(Proline betaine)和尿酸(Uric acid),它们的含量在肺癌患者尿液中明显增高,因此值得重点关注。经大批量样本验证并确认的与疾病相关的生物标志物,有利于了解疾病发生、发展的机理,为下一步生物学研究、临床诊断和个体化治疗提供重要的依据。4.治疗前后肺癌患者尿液的代谢组学比较研究在上述研究基础上,采用正、负离子检测模式相结合的RRLC-MS方法和多变量数据处理方法,开展了肺癌患者治疗前与治疗后尿液样本的代谢组学比较研究。结合临床疗效评价,以及可能生物标志物在健康状态、肺癌初诊与治疗后三个阶段的变化趋势,重点寻找与疗效相关的生物标志物,共发现了55个可能生物标志物在肺癌患者治疗前与治疗后尿液中的含量有显著性差异。同时将治疗前后的分组差异代谢物与前期寻找到肺癌相关的生物标志物进行相关性考察与分析,排除药物代谢物的影响后,结果发现14个代谢物在肺癌患者中显著增高,经过治疗且病情缓解后显著降低或其含量恢复接近健康人尿液水平,目前已鉴定出其中4个可能生物标志物的结构,包括苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和尿酸。通过本研究思路获得的生物标志物,不仅可作为肿瘤疾病诊断的生物标志物,而且有望作为与疗效相关的生物标志物,从而为临床肿瘤疾病的疗效评价和预后判断提供重要依据。