论文部分内容阅读
目的:炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)发病率的升高和环境因素密切相关,芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AHR)可以调节肠道内免疫细胞及非免疫细胞的活性,参与肠道免疫系统对外部环境因素的免疫应答。近期研究发现,miRNAs在固有免疫细胞中调节基因表达,包括肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IECs)。异常表达的miRNAs与某些人类自身免疫性疾病密切相关,如克罗恩病(Crohn’s disease,CD),但其机制目前仍不清楚。本研究的目的是明确靶向调节AHR表达的miRNAs如何调节肠上皮细胞的功能及其对克罗恩病发病机制的影响。方法:1.用实时定量PCR(qRT-PCR)检测活动期CD患者及健康对照者结肠粘膜组织中AHR mRNA的表达,免疫印迹法(western blotting)及免疫组化(immunohistochemistry,IHC)检测 AHR 蛋白的表达。2.用qRT-PCR检测活动期CD患者及健康对照者结肠粘膜组织中炎症相关miRNAs的表达情况,并通过Targetscan Human 6.2筛选其中与AHR 3 ’ UTR存在保守结合位点的miRNA。3.荧光素酶报告基因实验(luciferase reporter assay)分析miRNA与AHR 3’UTR的结合情况。4.过表达或抑制表达Caco-2细胞中的miRNA后,用Western blotting及qRT-PCR分别检测AHR蛋白和mRNA的表达情况。5.过表达或抑制表达Caco-2细胞中的miRNA后,用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激细胞,于24h后收集细胞培液上清,通过酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测炎性细胞因子的变化水平。结果:1.活动期CD患者病变肠组织中AHR蛋白表达水平与正常对照者肠组织相比明显降低,其mRNA水平则无明显变化。2.炎症相关miRNAs中miR-124明显升高,与AHR蛋白表达呈反向变化,且生物信息学预测表明AHR是miR-124的靶基因。3.荧光素酶报告基因实验结果提示miR-124可以与AHR3’ UTR特异性结合。4.在Caco-2细胞中过表达或抑制表达miR-124,可分别使AHR蛋白水平下降或正高,而AHR mRNA水平不受影响。5.在LPS刺激的Caco-2细胞中过表达miR-124,可以降低其靶基因AHR的表达,进而引起促炎细胞因子TNF-a、IL-6和IL-1 β分泌增加。结论:miR-124通过靶向调控AHR表达,对LPS诱导的结肠上皮细胞分泌促炎细胞因子的水平产生重要影响,可能参与了 CD的发生发展。。