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miRNA是一类由多细胞动物或植物基因组前体mRNA的内含子、独立转录单位或是miRNA基因簇编码的20个左右核苷酸大小的内源性的单链RNA,在转录后水平沉默特定基因从而对生物体基因表达起到精细调节的作用。Let-7是2000年发现的一种miRNA,细胞和活体水平试验表明let-7作为一种肿瘤抑制基因,在细胞增殖和分化的调节过程中发挥作用,因其表达稳定,let-7功能失调已被作为肺癌诊断和预后的临床标记物之一。目前let-7对已明确的靶基因主要是RAS和HMGA2,这两种基因在缺失let-7的情况下发生功能失调。人类3种RAS(包括HRAS,KRAS和NRAS)的3’UTRs包含多个假定的let-7互补位点,这些互补位点表明哺乳动物let-7家族很可能调控人类RAS表达。显然let-7通过RAS的3’UTRs负向调控人类细胞中RAS的表达。let-7通过作用于靶基因RAS,对RAS途径产生负向调节,肿瘤细胞表达let-7的量微乎其微,对RAS蛋白的合成产生去抑制作用,从而促进肿瘤细胞的增殖。而RAS也正是调控平滑肌细胞增殖、迁移和肥大的重要分子,在高血压发病过程中起重要作用。Let-7在血管平滑肌细胞增殖过程中是否与其在肿瘤细胞中有类似重要的调控作用尚不清楚。本研究的目的是检测let-7在高血压大鼠和正常血压大鼠血管平滑肌细胞中的表达差异,以及在血管平滑肌细胞中过表达let-7,探索其对血管平滑肌细胞增殖的影响,为高血压病的治疗提供新的靶点。第一部分: SHR和WKY主动脉平滑肌细胞的原代培养、传代以及两者microRNA表达谱差异分析目的:分析SHR和WKY主动脉平滑肌细胞间microRNA的表达差异方法:1、采用组织贴片法原代培养SHR和WKY主动脉平滑肌细胞:取10周龄雄性SHR和WKY大鼠的主动脉中膜行组织贴片法培养主动脉平滑肌原代细胞,每组6只,利用α-SM-actin对培养出的细胞进行鉴定。2、从两组原代细胞中提取总RNA,利用microRNA芯片技术对其进行分析,筛选出表达差异谱。3、利用RT-PCR方法对表达差异两倍以上的microRNA进一步确认:根据microRNA的序列设计其特异性的茎环状逆转录引物及PCR扩增的前向及逆向引物,提取细胞RNA在反转录酶的作用下先行反转录获取cDNA,cDNA在特异酶及引物作用下行PCR,并在PCR反应体系中加入荧光探针,利用荧光信号累积实时监测整个PCR过程,最后通过标准曲线对microRNA进行定量分析。结果:SHR和WKY主动脉平滑肌细胞的microRNA存在表达差异,经过microRNA芯片以及定量PCR技术,我们发现在SHR主动脉平滑肌细胞中上调2倍以上的microRNA有:mir-92b,mir-378,mir-219-2-3p;下调2倍以上的microRNA有:let-7d,let-7f,mir-98,mir-1,mir-500,let-7a,;let-7i,mir-34b等。结论:增殖能力完全不同的SHR和WKY大鼠主动脉平滑肌细胞中microRNA表达谱存在明显差异,下调显著的是let-7d,上调显著的有mir-92b。提示这些存在表达差异的microRNA在平滑肌细胞增殖过程中可能部分发挥作用,参与细胞的某些病理生理过程。第二部分: let-7d靶基因的预测及初步验证目的:通过生物信息学的方法初步预测、并筛选出可能与血管平滑肌细胞增殖密切相关的microRNA的靶基因。方法:运用miRanda、MiRBase、Pictar、TargetScan和BibiServ等靶基因预测软件检索let-7d可能的靶向基因,筛选出保守程度较高、结合自由能较低,并且与心血管系统病理生理过程相关的基因作为初步候选靶基因,同时参考已发表的、高影响因子的论文,我们选定KRAS,作为研究的靶基因。结果:(1)通过不同的预测软件,我们发现let-7d的多种可能靶基因,选定在心血管病理生理过程中发挥重要作用的RAS作为我们研究的目的基因。(2)参考已发表的各篇高影响因子论文,根据已有报道我们认为RAS在线虫、以及多种哺乳动物的细胞中,尤其是肿瘤细胞中是受到let-7的调控的。结论:生物信息学预测RAS可能是let-7d的靶基因,let-7d通过作用于KRAS的3’UTR端而起到抑制其基因表达的作用。第三部分:let-7d在血管平滑肌细胞内与KRAS的关系研究目的:在血管平滑肌细胞中分析let-7d与KRAS表达之间的调控关系方法:使用let-7d mimics转染SHR/WKY大鼠主动脉平滑肌细胞以及HCASMC,转染72小时,收集细胞,然后提取总蛋白,通过Western Blot的方法观察let-7d与KRAS之间的关系。结果:在上述三种血管平滑肌细胞中高表达let-7d,KRAS的表达水平发生相应的明显减低。结论:在血管平滑肌细胞中过表达let-7d,可以抑制KRAS的表达。推测let-7d可能是通过调节KRAS参与了血管平滑肌细胞相关疾病的病理生理过程。第四部分:let-7d对血管平滑肌细胞增殖的影响目的:利用SHR/WKY主动脉平滑肌细胞以及HCASMC,分析let-7d高表达对血管平滑肌细胞增殖的影响。方法:(1)在SHR/WKY主动脉平滑肌细胞以及HCASMC中利用let-7d mimics转染细胞,过表达let-7d,通过CCK-8试剂盒研究转染后48小时、72小时后细胞的增殖情况。(2)在SHR/WKY主动脉平滑肌细胞以及HCASMC中转染let-7d mimics/阴性对照,转染后48小时收集细胞,然后使用70%的乙醇固定1小时,用PI染色,进行流式细胞仪检测细胞周期,研究过表达let-7d对上述血管平滑肌细胞周期的影响。结果:(1)在血管平滑肌细胞中过表达let-7d,对于SHR-VSMCs, WKY-VSMCs and HCASMCs, 48小时的细胞增殖抑制率分别为28.11% (P<0.05), 18.77% (P<0.05)以及17.32% (P<0.01) ,而72小时的细胞增殖抑制率则分别为25.19% (P<0.05), 18.53% (P<0.01)以及18.27% (P<0.01)(。2)G1期的细胞比例明显增加,分别从54.25%到71.82% (SHR-VSMCs, P<0.01), 71.23%到91.21% (WKY-VSMCs, P<0.01) , 44.13%到56.81% (HCASMCs, P<0.01);而处于S期的细胞比例明显下降:从18.61%到13.87% (SHR-VSMCs, P<0.01), 14.58%到2.27% (WKY-VSMCs, P<0.01) ,28.43%到18.21% (HCASMCs, P<0.05);另外,G2期的细胞比例也同时下降:从27.14%到14.31% (SHR-VSMCs, P<0.01), 14.19%到6.51% (WKY-VSMCs, P<0.01) ,27.44%到24.97% (HCASMCs, P<0.01)。结论:在血管平滑肌细胞中过表达let-7d,可以调节细胞周期,抑制细胞增殖。