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拟南芥雌配子体发育经历了细胞分裂,核迁移,细胞化,细胞命运决定,细胞成熟等多个重要的生物学过程。胚囊细胞化后雌配子就已经形成,然后经历细胞生长,液泡扩张,极性的建立等过程形成成熟的雌配子,即中央细胞和卵细胞。它们分别和来自花粉管中的一对精子融合完成双受精,启动胚胎发生和胚乳的发育,最终形成成熟的种子。在雌配子发育和双受精过程中,中央细胞和卵细胞协同发育,同时形成成熟的雌配子,以便同时和精子分别融合,完成双受精。但是,迄今为止,中央细胞和卵细胞协同发育的机制仍不清楚。此外,早年的形态发育观察表明,雌配子形成之后需经历成熟时期才能够发育为功能完全的中央细胞和卵细胞。但该成熟时期的生物学意义,即该成熟过程中建立了何种分子机制,这些机制对受精和启动胚胎发生是否是必须的,或早期胚胎发生所需的母本机制是否在该时期建立,仍需要进一步的研究。本文以gcd1/GCD1突变体为主要研究材料,通过对该突变体在受精过程中的追踪观察、GCD1基因的表达模式及亚细胞定位分析、gcd1突变雌配子超微结构分析,并且借助特异启动子互补实验、人工特异细胞突变体的构建等实验方法,试图探讨雌配子成熟过程之于双受精以及胚胎发生启动的意义,揭示雌配子协同发育可能实际的分子机制。现将主要研究结果概括如下:1.在本研究室构建的拟南芥突变体库中,我们筛选到gcd1/GCD1突变体(gametic cell defective1),遗传学杂交表明gcd1突变雄配子体完全不能够遗传,雌配子体的遗传率也受到了显著的影响。gcdl为单拷贝T-DNA插入,TAIL-PCR表明该突变插入到GCD1基因的第一个外显子上。互补实验及GCD1另外一个等位基因突变体分析都表明gcdl突变表型确实是由于GCD1基因功能缺失造成的。同源序列比对以及进化树分析表明GCD1家族蛋白是一类新型的保守家族蛋白,其生化功能还完全不被了解。拟南芥中GCD1是该家族中唯一成员。并且在水稻、玉米等其他物种中该蛋白也只有一个或者近期进化而来的另外一个分支蛋白。表明GCDl在不同物种之间都具备相当保守的功能。2. pGCD1::GUS分析表明GCD1启动子在不同组织中都具有广泛的生物学活性。在幼叶、根、花序、角果、胚珠、花粉等组织都有很强的GUS信号。pGCD1::H2B_GFP分析表明雌性配子发育的各个阶段都有很强的表达。并且在早期胚胎发生和胚乳发育过程中也都有表达。GCD1_GFP融合蛋白分析表明该蛋白在早期雌配子体、成熟的雌配子体、合子、二细胞原胚、四细胞原胚、早期胚乳中都有高丰度的表达。暗示着GCD1在雌配子体发育、受精以及早期胚胎发生过程中有着重要的生物学功能。3.gcdl突变雌配子体分析表明gcdl中央细胞极核不能融合,并且卵细胞发育不成熟,主要表现为卵细胞大小及长度都偏小。表明gcdl突变影响了中央细胞和卵细胞的成熟。但是雌配子发育的早期阶段,包括细胞分裂、核迁移、胚囊细胞化等过程都没有受到影响。我们将pDD65::H2B_GFP、DD45_GFP、 AGL80_GFP、DD31_GFP等中央细胞、卵细胞以及助细胞的细胞命运决定相关marker转化到gcdl雌配子体中。结果表明gcdl雌配子体各个成员细胞的命运都没有改变。但是卵细胞和中央细胞的成熟明显受到影响。4.将野生型花粉授粉gcd1/GCD1突变体,透明观察发现所有的雌配子体都能够正常受精,表明gcdl不成熟的中央细胞及卵细胞也能够和精子融合。但是受精后胚胎停滞在合子时期,胚乳核也只能分裂1-2次。表明gcdl突变影响了胚胎发生的启动以及早期胚乳的发育。为了进一步证实gcdl雌配子能够受精。我们采用了两个父本基因受精后表达的marker, AGL80_GFP及GRP23_GUS。将这两个marker材料授粉于gcd1/GCDl突变体,我们也发现到败育的合子及胚乳中都有GFP或者GUS信号。进一步证实了gcdl雌配子能够和精子融合完成双受精,但是受精后合子的分裂以及早期胚乳的发育都受到了影响。5.gcd1中央细胞极核不能够融合,但是它们能够受精。为确认单极核和精子融合还是双极核和精子融合,以及gcdl中央细胞受精过程的详细行为,我们首先测量了gcd1/GCD1败育胚乳核的大小,发现所有的胚乳核大小都比较均一暗示着这些胚乳核都具有相同的倍性。其次我们用AGL80-GFP花粉授于gcdl雌蕊,受精后的gcd1/GCD1两个败育胚乳核被GFP荧光特异的标记。然后我们将该胚珠挑出来做透明观察,结果显示胚囊中也只有两个胚乳核。表明这两个胚乳核是gcdl两个极核和精子融合并且分裂一次的产物。此外,我们测量了gcd1/GCD1胚乳核的DNA含量,发现所有的胚乳核都是三倍体。表明可能是受精诱导了极核的融合,初生胚乳核是三核并合的产物。我们进一步观察了gcdl中央细胞受精的活体动态过程。将gcdl中央细胞核用GFP荧光特异标记,并且将带有红色荧光标记的精子授粉该突变体材料。我们能够观察到双极核受精的动态过程:首先精子和一个极核融合,然后另外一个极核也参与融合形成三倍体初生胚乳核。该活细胞动态观察结果也表明受精能够诱导极核的融合。6. pGCD1::H2B_GFP授粉于野生型柱头,我们观察到受精卵和初生胚乳细胞就有GFP信号。表明GCD1父本基因在受精后可迅速表达。而且GCD1_GFP父本基因受精后在合子及早期胚乳中都有表达。当将pGCD1::GCD1_GFP授粉于gcdl雌配子体后,能观察到GCD1_GFP融合蛋白在合子及胚乳中表达,但是该胚珠仍然败育。表明受精后补偿GCD1不能够恢复突变体败育的表型。我们收取到少量的杂交突变体种子。在子代中我们能够检测到GCD1_GFP融合蛋白在雌配子体中就表达,并且角果的育性也恢复正常。表明GCD1在雌配子体中的补偿能够恢复突变体的表型。因此,我们认为突变体胚和胚乳发育不正常是由于雌配子不成熟导致的。该结果证实了雌配子成熟的最后阶段对于受精不是必须的,但是对于胚胎发生的启动以及早期胚乳的发育时必须的。7.我们采用中央细胞特异启动子(FWA)驱动GCD1表达特异互补gcd1/GCD1突变体表型。我们发现中央细胞的发育能够恢复正常。而且卵细胞也恢复成熟。表明成熟的中央细胞能够释放正向信号促进卵细胞的发育。同时,我们也采用卵细胞特异启动子(DD45)驱动GCDl表达特异互补gcd1/GCD1突变体表型。结果表明卵细胞发育恢复正常。并且中央细胞的极核也开始融合。该结果表明成熟的卵细胞也能够释放正向信号促进中央细胞的发育。因此,我们认为中央细胞和卵细胞之间存在着正向信号调控促进彼此的发育,在这个双向信号的调控下,中央细胞和卵细胞最终同时发育成熟。我们也观察了恢复系受精后的发育情况,结果表明,当雌配子恢复成熟之后,合子重新启动分裂并且胚乳也开始发育。该结果也进一步证实了雌配子的成熟对于胚胎发生启动的重要性。而且,为了进一步证实FWA和DD45启动子的特异性,我们构建了pFWA:;GCD1_EGFP及pFWA::GCD1_EGFP载体。这两个载体也能够互补gcdl/GCD1突变体雌配子的发育以及角果的育性。并且我们也能够检测到融合蛋白特异的在中央细胞或者卵细胞中表达。进一步证实了中央细胞和卵细胞之间存在着正向信号调控促进彼此的发育,最终同时形成成熟的雌配子。8.GCD1蛋白亚细胞定位分析表明该蛋白定位于线粒体。超微结构分析表明gcdl中央细胞线粒体脊发育不正常。那么中央细胞和卵细胞之间的信号调控是否依赖于线粒体的结构呢?我们构建pMEA::aac2转化到野生型拟南芥中特异破坏中央细胞线粒体。结果表明中央细胞极核不能融合,并且卵细胞的发育也受到影响。表明不成熟的中央细胞不能够释放正向信号促进卵细胞的发育。因此,卵细胞发育也受到影响。同时,我们构建pDD45::aac2特异破坏卵细胞线粒体发育。结果表明卵细胞不能发育成熟。同时中央细胞的发育也受到影响。表明不成熟的卵细胞也不能够正常的释放正向信号促进中央细胞的发育。因此,中央细胞的极核不能够融合。该结果进一步证实了中央细胞和卵细胞之间的正向信号调控,并且该正向信号是一种线粒体依赖性的调控途径。综上所述,我们筛选到gcd1/GCD1突变体,该基因突变显著的影响的雌配子体遗传率,并且雄配子体完全不能够遗传。表达模式分析表明GCD1在雌雄配子体,早期胚和胚乳中都有很强的表达,表明GCD1在该时期可能有着重要的功能。表型分析表明gcdl突变特异的影响了中央细胞和卵细胞晚期成熟时期的发育。受精动态学观察表明gcdl不融合的极核能够连续的和精子融合完成受精,暗示受精能够诱导极核的融合。gcdl雌配子能够受精,但是受精后胚胎启动分裂和胚乳的发育都受到影响。GCD1在受精前雌配子中表达能够互补突变体的缺陷表型,在受精后早期胚和胚乳中表达不能够互补突变体表型。该结果表明雌配子的成熟对于受精不是必须的,但是对于合子的启动分裂和早期胚乳的发育是必须的。中央细胞和卵细胞特异启动子的互补实验结果表明,中央细胞和卵细胞之间存在着正向信号的调控促进彼此的发育,最终同时形成成熟的雌配子。人工特异破外中央细胞或者卵细胞的线粒体,结果发现两个雌配子的晚期成熟时期发育都受到影响。进一步证实了中央细胞-卵细胞之间的正向信号对于雌配子晚期发育的重要性,而且也证实该正向信号是一种线粒体依赖性的调控途径。